??? 摘? 要: 將核酸提取工藝與自動控制相結(jié)合,研發(fā)了HS9600全自動核酸提取儀。該儀器以機(jī)械臂運動控制為核心,結(jié)合移液器定量控制與試劑技術(shù),實現(xiàn)了核酸的分離與純化。文中詳細(xì)介紹了機(jī)械臂位置控制系統(tǒng)、移液器控制系統(tǒng)、溫控系統(tǒng)等關(guān)鍵模塊的設(shè)計方法,并描述了系統(tǒng)軟件的功能和設(shè)計思想。檢測證明該儀器運動控制穩(wěn)定,可靠性好,提取效果優(yōu),自動化程度高。?
??? 關(guān)鍵詞: 核酸提取;機(jī)械臂;移液器;溫度控制
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??? 基因重組、DNA序列分析、基因診斷與治療、基因擴(kuò)增和對目標(biāo)DNA的定量分析是科學(xué)研究與臨床診斷的基本方法,而這些檢測方法都需要從人體的血液、精液或者其他分泌物中提取核酸才能進(jìn)行。因此,核酸提取效率與純度的高低,直接影響后期研究工作的開展以及實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。?
??? 目前國內(nèi)多采用半自動,甚至手工方法提取核酸。手工方法耗時、繁瑣、核酸提取效率低,并且容易導(dǎo)致假陰性與交叉感染[1,2]。鑒于這種情況,課題組從多年的手工操作中吸取經(jīng)驗,結(jié)合試劑技術(shù),自行研制了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的HS9600全自動核酸提取儀,利用機(jī)械臂完成核酸的提取動作,實現(xiàn)無交叉感染、無菌的操作過程。該儀器大大減輕了操作人員的勞動強(qiáng)度、減少了人工操作過程中的失誤和感染,增強(qiáng)了生物制備過程的安全性、有效性,加快了核酸提取的自動化進(jìn)程,為分子生物學(xué)的研究提供了一種現(xiàn)代化的工具。?
1 基本原理?
??? 核酸是細(xì)胞的一種主要成分,支配著蛋白質(zhì)的合成,主宰著人體的生長、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等一切重大的生命活動,與人體的新陳代謝、免疫功能調(diào)節(jié)、健康長壽有著極其密切的關(guān)系,而且起著重要的、決定性的作用。核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起,因此,核酸提取是生命科學(xué)研究的首要前提。?
??? 核酸提取(核酸的分離與純化)主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開,但在分離核酸時,應(yīng)保證核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性,并排除其他分子污染。核酸提取方法一般包括細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個主要步驟,而每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯(lián)合實現(xiàn)[3]。?
??? 首先通過物理、化學(xué)或酶解作用裂解細(xì)胞,使核酸釋放出來,并去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂肪類等生物大分子的過程。在此基礎(chǔ)上,沉淀核酸、去除鹽類和有機(jī)試劑等雜質(zhì),從而得到純化的核酸。該過程通常采用離心澄清的方法,操作時費時費力。近年來,出現(xiàn)了磁珠分離技術(shù),利用磁珠在一定條件下對核酸具有很強(qiáng)親和力的特點,吸附核酸。當(dāng)條件改變時,磁珠又可以與其吸附的核酸分離,從而得到純化的核酸。這種方法簡便、高效、易于操作,是目前核酸提取的主要方法[4]。?
??? 為提高效率,降低核酸提取過程的失誤與污染,打破磁珠試劑在核酸提取技術(shù)上形成的技術(shù)和市場壟斷,課題組經(jīng)過幾年研制,自主開發(fā)出適用于核酸純化的高性能吸附劑,為國內(nèi)自動化提取純化核酸開辟了新的技術(shù)發(fā)展路線;在此基礎(chǔ)上,研發(fā)了HS9600全自動核酸提取儀,替代了傳統(tǒng)的手工操作,實現(xiàn)批量化提純。其提取工藝如圖1所示。?
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??? 由圖1可知,HS9600全自動核酸提取儀是基于膜分離法而設(shè)計的,在細(xì)胞膜裂解的基礎(chǔ)上,通過吸附試劑,使核酸成為大分子(結(jié)合核酸),實現(xiàn)核酸分子與其他生物分子分離;再用洗脫液,使核酸脫離,變?yōu)樾》肿?并通過濾膜得到純化的核酸。其過程如下:?
??? (1)裂解:在樣品中加入裂解液,打碎細(xì)胞膜;?
??? (2)吸附:在樣品裂解液中加入吸附劑,充分混合,利用核酸的特異性,使其吸附到吸附劑上,蛋白質(zhì)等分子則不被吸附,再利用濾膜,使核酸分子與其他生物分子分離;?
??? (3)洗滌:將吸附的核酸反復(fù)洗滌,去除雜質(zhì);?
??? (4)洗脫:將吸附的核酸烘干,然后轉(zhuǎn)至洗脫緩沖液中,核酸就從吸附劑上被洗脫下來,變成小分子形式,通過濾膜,得到純化的核酸。?
2 系統(tǒng)設(shè)計?
??? HS9600全自動核酸提取儀由機(jī)械與電控兩部分組成。其中,機(jī)械部分由機(jī)架、縱向驅(qū)動部件、橫向驅(qū)動部件、升降機(jī)械臂、烘干器及工作臺等零部件構(gòu)成。其結(jié)構(gòu)布局按照核酸提取的基本流程分為5個工位。工作臺上分別放置裂解液、吸附劑、洗滌液、洗脫液、一次性槍頭、樣品以及空試管等。而電控部分由控制器、步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動器、步進(jìn)電機(jī)、溫度傳感器和加熱器等部件組成。當(dāng)提取儀工作時,控制系統(tǒng)驅(qū)動機(jī)械臂橫向和縱向移動,自動進(jìn)行裝卸槍頭、定量取液、吹打、排液、加溫等工序而完成所選定的工藝流程。其結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示。?
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??? 由圖2可知,整個控制系統(tǒng)采用上下位機(jī)結(jié)構(gòu)模式,下位機(jī)始終處于監(jiān)聽狀態(tài),其所有任務(wù)受上位機(jī)指派并完成機(jī)械臂的三維運動、自動裝卸槍頭、定量吸液、吹打溶液、控溫等,實現(xiàn)全自動無人操作的核酸提取過程。?
2.1 機(jī)械臂位置控制系統(tǒng)?
????核酸提取儀的主要任務(wù)是把裂解液、吸附劑、洗滌液分別與血樣混合在一起,并充分吹打、排空,通過加熱到某一特定溫度,再通過添加洗脫液提取核酸的過程。整個操作要求機(jī)械臂定位準(zhǔn)確。一是因為機(jī)械臂上的移液器在向血樣添加不同液體時,要多次插進(jìn)同一血樣試管里;二是在取液中,有一道工序是取槍頭,即要把槍頭自動裝到移液器上,此時,在機(jī)械臂的升降運動中,要求位置誤差不能超過0.1mm。因此,系統(tǒng)采用了滾珠絲桿精確定位。?
????整個機(jī)械臂的三維運動由步進(jìn)電機(jī)控制,其驅(qū)動器采用SH-2034M,通過上位機(jī)計算得到位移的脈沖數(shù),向單片機(jī)發(fā)出相應(yīng)的位移指令,單片機(jī)通過I/O定時發(fā)出高低電平信號控制步進(jìn)電機(jī)的轉(zhuǎn)動和停止。?
????步進(jìn)電機(jī)的軟件設(shè)計分啟動升速、途中勻速、到位降速三步進(jìn)行,采用如圖3所示的梯度曲線逼近加減速曲線,并利用單片機(jī)定時器中斷方式控制步進(jìn)電機(jī)的速度。這個功能靠不斷改變定時器裝載值的大小實現(xiàn)。?
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2.2 移液器控制系統(tǒng)?
??? HS9600提取儀的研制是圍繞高精確度多通道移液器這個關(guān)鍵部件開展的。向血樣中添加試劑準(zhǔn)確與否直接關(guān)系到核酸的純化程度高低,在對電子移液器進(jìn)行充分的市場調(diào)研之后,本提取儀選定由芬蘭BIOHIT公司生產(chǎn)的ePET系列電子移液器(12通道,移液范圍50μl～1200μl)。但該電子移液器并沒有標(biāo)準(zhǔn)的計算機(jī)接口,需要對其進(jìn)行二次開發(fā),以便于全自動提取儀定量移液。?
??? 移液器的工作原理是微電機(jī)帶動活塞運動,通過吸筒吸取定量的液體,吸液的多少由光電檢測電路判斷。整個電路由微電機(jī)驅(qū)動電路與脈沖檢測電路構(gòu)成,其微電機(jī)驅(qū)動電路如圖4所示。?
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??? 驅(qū)動元件選用場效應(yīng)管IRF3205[5],其中1、4配對構(gòu)成正向控制電路;3、2配對構(gòu)成反向控制電路。此外,為使系統(tǒng)調(diào)試、維護(hù)方便,用2個發(fā)光管指示微電機(jī)的工作方式:紅燈表示電機(jī)正向轉(zhuǎn)動;藍(lán)燈表示電機(jī)反向轉(zhuǎn)動;若2個燈都不亮,表示電機(jī)不工作。?
??? (1)D1=1,場效應(yīng)管全部截止,電機(jī)不工作;?
??? (2)D1=0,D2=0,場效應(yīng)管1、4導(dǎo)通,3、2截止,電機(jī)正轉(zhuǎn)(吸液);?
??? (3)D1=0,D2=1,場效應(yīng)管3、2導(dǎo)通,1、4截止,電機(jī)反轉(zhuǎn)(吹液)。?
??? 工作中,設(shè)定好吸液量之后,啟動微電機(jī)工作,其運行速度快慢由PWM占空比實現(xiàn)。PWM的占空比越大,電機(jī)轉(zhuǎn)動的速度越快。?
??? 移液器旋轉(zhuǎn)的脈沖檢測電路如圖5所示。在微電機(jī)的軸上裝有一個輪盤,輪盤上開有均勻間隔的豁槽;發(fā)光管通過豁槽,將光投射到前后放置的T1、T2兩個光敏三極管上;兩個光敏三極管的集電極1、2上產(chǎn)生兩路正交的脈沖信號 ,這兩路正交的脈沖經(jīng)過信號處理電路后,從信號處理電路的3和4輸出。?
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??? 若微電機(jī)正轉(zhuǎn),即移液器吸液,則在信號處理電路的3端得到一系列脈沖,其脈沖頻率與1、2脈沖頻率相同,而4端始終是低電平信號。?
??? 若微電機(jī)反轉(zhuǎn),即移液器吹液,則在信號處理電路4端得到一系列脈沖,其脈沖頻率與1、2脈沖頻率相同,而3端始終是低電平信號。?
??? 單片機(jī)用兩個計數(shù)器分別計數(shù)3和4上的脈沖,就可以感知電機(jī)轉(zhuǎn)動的方向和角度大小,從而間接檢測吸液筒的活塞運動距離,最終控制吸液、吹液量的多少,以實現(xiàn)提取儀自動操作。?
2.3 溫控系統(tǒng)?
??? 為了提高核酸提取純度,在充分洗滌的基礎(chǔ)上,需要將吸附劑結(jié)合的核酸烤干,而溫度的高低與溫度的波動對核酸的提取影響也比較大。因此,需要一個恒定的溫度進(jìn)行烘烤,才能取得滿意的核酸提取結(jié)果。?
??? 在核酸提取儀中,溫控系統(tǒng)包括溫度控制與溫度測量兩部分,溫度控制類似于電阻爐爐溫調(diào)節(jié),調(diào)節(jié)器采用積分分離、增量式PID調(diào)節(jié)器,可以有效抑制過沖現(xiàn)象。其控制器參數(shù)采用實驗方法,由試湊法確定。另外在控溫過程中,根據(jù)當(dāng)前溫度與設(shè)定溫度偏離的遠(yuǎn)近,采用不同的比例系數(shù),抑制控溫過程的超調(diào)與純滯后環(huán)節(jié)。其計算公式如下:?
??? Δu(k)=kP(k)[e(k)-e(k-1)]+kLkIe(k)?
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式中,e為偏差;Δu為控制增量;kP為比例系數(shù); kI為積分系數(shù);ε為偏差的門限值;k0為常數(shù);β為可變比例系統(tǒng)的增益,它與偏差成反比關(guān)系。?
??? 為避免模擬電路技術(shù)設(shè)計中面臨的一系列問題(如引線誤差補(bǔ)償和信號調(diào)理電路的誤差等),溫度測量部分采用美國Dallas半導(dǎo)體公司推出的數(shù)字溫度傳感器DS18B20[6],它具有獨特的單總線接口,僅需要占用一個通用I/O端口即可完成與微處理器的通信;其測量溫度范圍為-55℃～+125℃,具有可編程的9位～12位A/D轉(zhuǎn)換精度,測溫分辨率可達(dá)0.0625℃,大大簡化了電路設(shè)計,并能滿足系統(tǒng)性能要求。?
2.4 系統(tǒng)軟件?
??? 全自動核酸提取儀的軟件由上位機(jī)軟件和下位機(jī)軟件兩部分組成。?
??? 在單片機(jī)上運行的軟件稱為下位機(jī)軟件,采用匯編語言開發(fā)。下位機(jī)軟件采用模塊化設(shè)計方法,主要包括(1)通信模塊,與上位機(jī)通信,接收上位機(jī)的命令,并作出應(yīng)答;(2)控溫模塊,根據(jù)上位機(jī)設(shè)定的溫度進(jìn)行控溫;(3)機(jī)械臂移動模塊,根據(jù)上位機(jī)的命令進(jìn)行機(jī)械臂的移動;(4)移液器控制模塊,根據(jù)上位機(jī)的命令進(jìn)行吸液、吹液和脫槍頭等。?
??? 在PC機(jī)上運行的軟件稱為上位機(jī)軟件,采用VB.NET語言開發(fā)。上位機(jī)軟件主要有三個功能:(1)與下位機(jī)通信,命令下位機(jī)執(zhí)行控溫、機(jī)械臂移動、吸液、吹液和脫槍頭等動作;(2)系統(tǒng)各種數(shù)據(jù)的管理和處理;(3)提供方便的人機(jī)對話界面,使用戶可通過鍵盤、鼠標(biāo)和顯示屏,實現(xiàn)核酸提取工藝的編輯、儀器運行狀態(tài)的顯示和核酸提取過程的控制。其軟件結(jié)構(gòu)見圖6。?
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?? 上位機(jī)軟件主要由五大模塊構(gòu)成:(1)參數(shù)設(shè)置模塊,完成各個提取動作的參數(shù)編制,主要是烘干區(qū)溫度、各個溶液(包括:裂解液、洗滌液、洗脫液)的每次移液量與添加量,機(jī)械臂升降的位置,吹打的位置等參數(shù)設(shè)置。(2)提取工藝組合模塊,本系統(tǒng)配有幾個常用標(biāo)準(zhǔn)動作:裂解、吹打、洗滌、烘干、洗脫、延時等,可根據(jù)實際需要將標(biāo)準(zhǔn)動作進(jìn)行組合,簡化了規(guī)程的設(shè)計。(3)提取模塊,主要功能是通過控制機(jī)械臂的運動,帶動核酸在不同緩沖液之間的轉(zhuǎn)移。這些功能的實現(xiàn)都是靠上下位機(jī)之間的數(shù)據(jù)交互,依據(jù)編輯的提取規(guī)程,進(jìn)行核酸的分離與純化。(4)系統(tǒng)維護(hù)模塊,該模塊方便了計量工作的鑒定和維護(hù)工程師對儀器的各個部件進(jìn)行測試,如:移液量的標(biāo)定、溫度恒溫測定、機(jī)械臂位置自檢等。?
3 儀器性能?
??? HS9600全自動核酸提取儀(1臺)經(jīng)檢測,其安全指標(biāo)和性能指標(biāo)均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。其中移液精度與溫控精度的實測曲線如圖7和圖8所示。?
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??? 圖7為分別設(shè)定移液量為100μl、200μl、300μl的條件下,提取儀自動吸取蒸餾水所得到的曲線。由圖可知,在100μl時,移液器的最大絕對誤差為1.4μl;在200μl時,最大絕對誤差為3.9μl;在300μl時,最大絕對誤差為3.4μl。滿足預(yù)期設(shè)計的要求。?
??? 圖8為分別設(shè)定目標(biāo)溫度為50℃、70℃、90℃時,提取儀的控溫曲線。可以看出,在設(shè)定溫度為50℃時,系統(tǒng)的最大絕對誤差為0.3℃;在70℃時,最大絕對誤差為0.4℃;在90℃時,最大絕對誤差為0.5℃。儀器的控溫精度可達(dá)±0.5℃。?
??? 儀器的各項性能指標(biāo)如下:?
??? (1)加熱溫度范圍:50℃～100℃;?
??? (2)加熱控溫精度:±0.5℃;?
??? (3)處理樣品容量:50μl～150μl;?
??? (4)加熱模塊均勻度:±2℃;?
??? (5)移液精度:±5μl;?
??? (6)移液準(zhǔn)確度:±5μl;?
??? (7)移液均勻度:±5μl。?
HS9600全自動核酸提取儀采用模塊化組合設(shè)計的思想,由上下位機(jī)依據(jù)自己的特點,分別承擔(dān)不同的任務(wù),大大提高了儀器的自動化程度,替代了傳統(tǒng)的手工操作,實現(xiàn)批量化提純,可以一次處理96個樣品。?
??? 與傳統(tǒng)的手工操作過程相比,該儀器不僅節(jié)約了大量時間,而且避免了樣本交叉污染,滿足高通量實驗的要求。自動化操作更保證了實驗結(jié)果的穩(wěn)定可靠,滿足了便捷、高效、準(zhǔn)確的核酸檢測要求。該儀器與達(dá)安核酸提取吸附劑配套使用,打破磁珠試劑在核酸提取技術(shù)上形成的技術(shù)和市場壟斷,為廣大客戶提供了更為全面和完善的實驗解決方案。?
參考文獻(xiàn)?
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