自DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解析開始，人們?cè)谔骄拷】蹬c疾病基因組復(fù)雜性與差異性上付出巨大努力，測(cè)序通量限制和高昂成本成為人們深入分析基因組的首要障礙，2005年推出高通量測(cè)序技術(shù)初步解決了這個(gè)問題，人類基因組測(cè)序成本迅速下降，由此產(chǎn)生一個(gè)新名詞：下一代測(cè)序(next-generation sequencing， NGS)。在過去十多年，NGS不斷進(jìn)化，人類基因組測(cè)序成本已經(jīng)下降至1 000美元/人。

　　一、NGS技術(shù)平臺(tái)、發(fā)展趨勢(shì)及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

　　國(guó)內(nèi)臨床應(yīng)用短讀長(zhǎng)NGS技術(shù)主要基于邊合成邊測(cè)序(sequencing-by-synthesis， SBS)的Life平臺(tái)和Illumina平臺(tái)。Life Ion-Torrent平臺(tái)采用單核糖核酸增加(single-nucleotide addition， SNA)方法，Illumina平臺(tái)依賴于循環(huán)可逆終止(cyclic reversible termination， CRT)技術(shù)。盡管短讀長(zhǎng)NGS平臺(tái)總體準(zhǔn)確率較高(>98%)，但讀取高AT或高GC片段錯(cuò)誤率仍差強(qiáng)人意。由于基因組包含重復(fù)序列、結(jié)構(gòu)變異及拷貝數(shù)變化，短讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)解析這些信息存在固有缺陷，近幾年相繼推出基于單分子測(cè)序和合成法測(cè)序第三代測(cè)序。PacBio Biosciences單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，其PacBio RS Ⅱ平均測(cè)序讀長(zhǎng)10 000～15 000 bp。2014年，另一種基于納米單分子測(cè)序技術(shù)原型機(jī)-MinION誕生，平均測(cè)序讀長(zhǎng)>10 000 bp。合成法長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)發(fā)展有2個(gè)系統(tǒng)：Illumina長(zhǎng)片段合成系統(tǒng)與10×Genomics乳液系統(tǒng)。第三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)單個(gè)堿基錯(cuò)誤率較高。

　　NGS技術(shù)廣泛應(yīng)用于常規(guī)臨床實(shí)踐，應(yīng)用領(lǐng)域包括無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(noninvasive prenatal test，NIPT)和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(preimplantation genetic diagnosis/preimplantation genetic screening，PGD/PGS)、遺傳病、腫瘤、藥物基因組等。2014年6月，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)首個(gè)NGS診斷產(chǎn)品用于胎兒染色體非整倍體檢測(cè)。NIPT是國(guó)內(nèi)NGS應(yīng)用最為成熟的領(lǐng)域。NGS應(yīng)用于PGD/PGS優(yōu)點(diǎn)在于能夠利用單一平臺(tái)實(shí)現(xiàn)單基因病和染色體異常分析。2014年9月我國(guó)誕生世界首例應(yīng)用多重退火成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行胚胎全基因組擴(kuò)增NGS測(cè)序試管嬰兒。隨著檢測(cè)費(fèi)用降低和基因解讀能力提高，NGS應(yīng)用遺傳病特別是罕見病，已經(jīng)由基因組合向全外顯子測(cè)序(whole exome sequencing，WES)和全基因組測(cè)序(whole genome sequencing，WGS)轉(zhuǎn)變。2010年，應(yīng)用WES技術(shù)僅通過4個(gè)病例WES即發(fā)現(xiàn)米勒綜合征致病基因DHODH。2016年一項(xiàng)前瞻性研究評(píng)估證實(shí)單病例WES作為一線分子檢測(cè)技術(shù)用于新生兒?jiǎn)位蚣膊≡\療臨床效用性。2016年另一項(xiàng)涉及54個(gè)國(guó)家1 000個(gè)家庭研究表明，WGS對(duì)未確診疾病診斷率比經(jīng)典遺傳診斷方法還高。

　　目前腫瘤NGS檢測(cè)主要應(yīng)用于遺傳性腫瘤綜合征篩查和體細(xì)胞突變分析。NGS使腫瘤防治措施前移至預(yù)防階段。大量研究證實(shí)某些遺傳性腫瘤與關(guān)鍵基因突變相關(guān)，2017版美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南指出可利用NGS檢測(cè)相關(guān)基因突變并行遺傳咨詢。如與遺傳性乳腺癌和卵巢癌、林奇綜合征和神經(jīng)纖維瘤等相關(guān)高外顯率基因突變等，此外還有一些中等外顯率和低外顯率基因。NGS在體細(xì)胞突變分析領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛，通過NGS分析腫瘤起始、發(fā)展和轉(zhuǎn)移階段遺傳變異及相關(guān)驅(qū)動(dòng)突變和伴隨突變，有助于腫瘤患者分類、預(yù)后、靶向治療、耐藥性分析。國(guó)際上相繼成立多個(gè)測(cè)序計(jì)劃致力于破譯癌癥細(xì)胞突變模式。癌癥基因組計(jì)劃已經(jīng)發(fā)掘近500萬個(gè)腫瘤體細(xì)胞基因突變，并建立了全世界最大、最廣泛的癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫(kù)。這些大量前期工作為后續(xù)NGS臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。如今臨床利用腫瘤熱點(diǎn)突變基因組合，可在1 d內(nèi)對(duì)幾百個(gè)腫瘤相關(guān)基因幾千個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)進(jìn)行快速檢測(cè)。

　　腫瘤液體活檢和單細(xì)胞測(cè)序是NGS應(yīng)用新方向。腫瘤患者外周血含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)或者游離腫瘤DNA(circulating tumour DNA，ctDNA)。CTC和ctDNA取材便利，適用于腫瘤個(gè)體化診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。2014年一項(xiàng)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者血漿ctDNA NGS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)Ⅱ～Ⅳ期NSCLC檢測(cè)敏感性100%。由于常規(guī)測(cè)序樣品來源均是多細(xì)胞混合DNA，得到的序列信息是一群細(xì)胞基因信息平均值，或其中占優(yōu)勢(shì)數(shù)量細(xì)胞DNA信息，而單個(gè)細(xì)胞特性被忽視。單細(xì)胞NGS測(cè)序能夠揭示細(xì)胞個(gè)體間差異，可為腫瘤分子分型和個(gè)體化治療提供精細(xì)化指導(dǎo)，有助于準(zhǔn)確理解腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性和腫瘤演進(jìn)。

　　越來越多證據(jù)表明，在相關(guān)藥物代謝通路，編碼藥物代謝酶或相關(guān)蛋白基因遺傳變異決定個(gè)體藥物反應(yīng)或藥物敏感性。不同患者對(duì)同一藥物毒性和療效有不同反應(yīng)。臨床藥物基因組學(xué)發(fā)展日新月異。截至目前，美國(guó)食品藥品管理局公布了140余種藥物，建議通過遺傳信息指導(dǎo)其合理使用，美國(guó)臨床遺傳藥理學(xué)應(yīng)用委員會(huì)發(fā)布了35個(gè)藥物臨床藥物基因組學(xué)應(yīng)用指南。目前個(gè)體化用藥主要針對(duì)某種藥品開展一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因分型篩查。例如某些針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體靶向藥基因突變檢測(cè)、鉑類藥物相關(guān)敏感性基因檢測(cè)和細(xì)胞色素P450家族基因如CYP2D6分型檢測(cè)等。影響藥物代謝或敏感性基因很多，應(yīng)用NGS技術(shù)可以得到單個(gè)患者成百上千個(gè)基因分型結(jié)果，全面指導(dǎo)其用藥。

　　二、NGS技術(shù)臨床應(yīng)用質(zhì)控問題的現(xiàn)狀和解決辦法初探

　　NGS檢測(cè)比常規(guī)分子檢測(cè)復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)操作部分和生物信息分析部分包括眾多實(shí)驗(yàn)處理和分析程序。從樣本制備到數(shù)據(jù)分析，NGS過程每一步都可能混入錯(cuò)誤。因此凸顯臨床檢測(cè)質(zhì)控重要性。2015年，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心NGS檢測(cè)體細(xì)胞突變有效性室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分析表明，64家參評(píng)實(shí)驗(yàn)室僅33家檢測(cè)性能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，只有17家實(shí)驗(yàn)室能正確識(shí)別基因組合所有突變，充分反映NGS檢測(cè)過程復(fù)雜性和制定統(tǒng)一檢測(cè)規(guī)范迫切性[12]。目前NGS缺乏統(tǒng)一行業(yè)規(guī)范和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室不同平臺(tái)檢測(cè)結(jié)果無法比較。需要對(duì)NGS實(shí)驗(yàn)操作部分和生信分析部分建立執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控監(jiān)測(cè)事項(xiàng)。包括建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程、驗(yàn)證流程、質(zhì)量管理體系、數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證等。生物信息分析部分應(yīng)包括：變異結(jié)果描述、附帶結(jié)果報(bào)道、數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和版本可追溯性等。此外，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用應(yīng)貫穿在NGS檢測(cè)整個(gè)流程。

　　三、NGS技術(shù)臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)分析要點(diǎn)和報(bào)告內(nèi)容及格式要求

　　NGS實(shí)驗(yàn)室對(duì)變異結(jié)果描述及報(bào)告需遵循專業(yè)組織建議與指導(dǎo)。建議遵循人類基因組變異協(xié)會(huì)命名指南和美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)遺傳疾病變異分類指導(dǎo)。為避免結(jié)果混淆，在撰寫臨床結(jié)果報(bào)告時(shí)，需要詳細(xì)列出每個(gè)變異位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本版本號(hào)及蛋白編號(hào)[12，14]。在描述疑似致病性變異時(shí)，需充分考慮疾病表型、不同人群發(fā)病率、外顯率及功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，并需要充分利用一些公共數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于一些外顯子組或基因組檢測(cè)來說，評(píng)估一個(gè)基因?qū)膊∮绊懗潭龋私獠煌儺愵愋蛯?duì)疾病貢獻(xiàn)度及這些變異遺傳模式至關(guān)重要[12，15]。報(bào)告內(nèi)容和格式要求可參考中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)師分會(huì)發(fā)布的《臨床基因檢驗(yàn)診斷報(bào)告模式專家共識(shí)》、美國(guó)分子病理學(xué)會(huì)、美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)和美國(guó)病理學(xué)會(huì)專家共識(shí)。以及歐盟NGS診斷指南[17]。NGS檢測(cè)報(bào)告清晰性和一致性至關(guān)重要，應(yīng)準(zhǔn)確客觀地描述所檢驗(yàn)結(jié)果，避免引起歧義。內(nèi)容總體應(yīng)該明確簡(jiǎn)潔并具有充分解釋。

　　四、我國(guó)NGS技術(shù)發(fā)展需要注意的幾個(gè)問題

　　當(dāng)前國(guó)內(nèi)NGS技術(shù)硬件和國(guó)外發(fā)展同步，但軟件建設(shè)滯后，硬件建設(shè)可以通過購(gòu)買迅速完成，軟件建設(shè)需要長(zhǎng)時(shí)間積累。軟件建設(shè)包括適合國(guó)內(nèi)國(guó)情的規(guī)范的檢測(cè)指南，合理有效的監(jiān)管措施，完善數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)以及符合患者需求的遺傳咨詢體系等。此外，為保證臨床和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室溝通順暢，需要積極提倡中文人類表型標(biāo)準(zhǔn)用語。隨著基因測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，獲取基因數(shù)據(jù)越來越便捷，與之對(duì)應(yīng)表型信息采集效率滯后。由于臨床醫(yī)學(xué)歷史悠久，疾病命名和分類復(fù)雜多樣;很多疾病存在臨床變異性，不同醫(yī)師對(duì)于患者描述也存在差異。模糊表型信息與基因數(shù)據(jù)連接存在障礙，給基因數(shù)據(jù)解讀帶來困難。

　　五、展望

　　隨著NGS技術(shù)不斷改進(jìn)，高通量長(zhǎng)讀長(zhǎng)NGS將是大勢(shì)所趨，檢測(cè)對(duì)象將逐漸從DNA層面向RNA層面轉(zhuǎn)移。新一代NGS檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確性和操作便捷性將大大提高。我們有理由相信隨著檢測(cè)費(fèi)用持續(xù)下降、測(cè)序方法優(yōu)化升級(jí)、數(shù)據(jù)解讀能力智能化以及臨床經(jīng)驗(yàn)不斷積累，人員培訓(xùn)、數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制、倫理等問題都將迎刃而解，NGS技術(shù)將會(huì)逐漸成為臨床主要且常規(guī)的檢測(cè)項(xiàng)目。