陳舒，陳若寒

　?。ǜ＝ň鞂W(xué)院 計(jì)算機(jī)與信息安全管理系，福建 福州 350007）

       摘要：腫瘤癌變細(xì)胞FISH圖像分析系統(tǒng)中，需要解決粘連細(xì)胞核的分割問題。FISH屬于新興技術(shù)，產(chǎn)生的是特殊的熒光彩色細(xì)胞圖，現(xiàn)有細(xì)胞圖像分析方法并不適用。文章創(chuàng)新設(shè)計(jì)了基于深度凹陷檢測和構(gòu)造自然凹陷力的方法，分離粘連細(xì)胞核。首先，針對(duì)參差不齊的實(shí)驗(yàn)成像，在RGB模型下結(jié)合統(tǒng)計(jì)思想，將圖像分為三類，分別進(jìn)行預(yù)處理。繼而，利用融合了Kmeans聚類算法的改進(jìn)馬爾科夫隨機(jī)場（MRF）方法，將細(xì)胞核與癌變信號(hào)點(diǎn)進(jìn)行有效提取。在此基礎(chǔ)上，利用幾何原理，創(chuàng)新設(shè)計(jì)了一套粘連細(xì)胞核分離算法。最后，給出細(xì)胞核快速計(jì)數(shù)和信號(hào)點(diǎn)提取方法。該系統(tǒng)設(shè)計(jì)基本完整，并達(dá)到預(yù)期效果。

　　關(guān)鍵詞：FISH圖像；細(xì)胞核提取；MRF模型；細(xì)胞核粘連；自然凹陷力

　　中圖分類號(hào)：R857.3;TP391文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI： 10.19358/j.issn.1674-7720.2017.01.015

　　引用格式：陳舒，陳若寒. 腫瘤癌變細(xì)胞FISH圖像分析系統(tǒng)的研究［J］.微型機(jī)與應(yīng)用，2017,36（1）：48-51，55.

0引言

　　較多研究表明，癌變細(xì)胞中都存在HER2蛋白的過表達(dá)或基因擴(kuò)增現(xiàn)象。當(dāng)前的檢測技術(shù)有很多種，其中的FISH技術(shù)雖是一項(xiàng)新興技術(shù)但已經(jīng)被公認(rèn)為業(yè)界的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”［12］。

　　經(jīng)過FISH技術(shù)處理后產(chǎn)生的腫瘤癌變細(xì)胞圖像中，包含三個(gè)主要成分：背景（黑色）、細(xì)胞核（藍(lán)色）、信號(hào)點(diǎn)（紅色和綠色）。通過統(tǒng)計(jì)、分析細(xì)胞核與信號(hào)點(diǎn)的個(gè)數(shù)，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)HER2蛋白擴(kuò)增現(xiàn)象的檢測。

1預(yù)處理

　　FISH圖像中，具有研究價(jià)值的區(qū)域恰好與RGB顏色模型的三個(gè)通道相吻合，不需要進(jìn)行復(fù)雜的映射或者換算，所以選用RGB模型來進(jìn)行設(shè)計(jì)。通過批量觀察以及相應(yīng)資料的查閱，F(xiàn)ISH技術(shù)呈現(xiàn)的細(xì)胞核大致具有3個(gè)特點(diǎn)：邊緣模糊（熒光強(qiáng)度不同）、核外輪廓各異（探針手工著色）、核內(nèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜（孔洞），需要進(jìn)行預(yù)處理使得圖像呈現(xiàn)最佳效果，從而簡化算法。

　　1.1FISH圖像分類

　　首先，根據(jù)成像的熒光效果，將圖像分為三類：（1）弱熒光信號(hào)圖；（2）暈染嚴(yán)重信號(hào)圖；（3）理想信號(hào)圖。分別如圖1（a）、（b）、（c）所示。在專家指導(dǎo)下進(jìn)行手工分類作為訓(xùn)練樣本，得出圖像在藍(lán)色通道上的分布規(guī)律，借助統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，進(jìn)行自動(dòng)分類。

　　1.2非理想圖片的改善

　　需要對(duì)弱熒光圖進(jìn)行增強(qiáng)，對(duì)暈染現(xiàn)象進(jìn)行去除。

　　1.2.1弱熒光圖自適應(yīng)增強(qiáng)

　　（1）原圖像進(jìn)行疊加，I=1.5×I（這步操作的實(shí)質(zhì)是對(duì)亮度進(jìn)行疊加）；

　?。?）重新判斷是否為弱熒光，如果是，則重新轉(zhuǎn)入步驟（1），否則停止。實(shí)驗(yàn)效果如圖2所示。

　　1.2.2暈染現(xiàn)象的自動(dòng)去除

　?。?）將判別為“暈染嚴(yán)重”的原始圖像轉(zhuǎn)化為藍(lán)色亮度圖；

　?。?）運(yùn)用Otsu法進(jìn)行閾值分割，目標(biāo)標(biāo)記為1（白），背景標(biāo)注為0（黑）；

　?。?）填補(bǔ)小于閾值Pc個(gè)像素點(diǎn)的連通區(qū)域（孔洞）；

　?。?）去除小于閾值Pc個(gè)像素點(diǎn)的連通區(qū)域（非細(xì)胞核區(qū)域）；

　?。?）將標(biāo)記為目標(biāo)的區(qū)域恢復(fù)成RGB圖，其他部分保持黑色背景；

　?。?）重新判斷是否暈染嚴(yán)重，如果是，則重新轉(zhuǎn)入步驟（2），否則停止。實(shí)驗(yàn)效果如圖3。

　　其中Pc默認(rèn)為原圖總像素點(diǎn)的4%，這個(gè)百分比是根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)效果得出的經(jīng)驗(yàn)值，表示該圖片中的細(xì)小孔洞，可以自適應(yīng)各種尺寸的原始圖像。

2FISH圖像細(xì)胞核的提取

　　2.1傳統(tǒng)方法

　　對(duì)細(xì)胞核提取的常用方法主要依據(jù)四類原理，分別是：閾值分割、邊緣檢測、傳統(tǒng)區(qū)域思想以及基于特殊算法的理論［34］。

　　閾值分割雖然快速簡便、不需要先驗(yàn)知識(shí)，卻沒有考慮與鄰域像素點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性，分割較為粗糙，容易發(fā)生誤判；邊緣檢測雖然是基于各個(gè)像素點(diǎn)與其鄰域的差異，但是細(xì)胞核內(nèi)熒光信號(hào)產(chǎn)生了大量的梯度變化，給真實(shí)邊緣的檢測增加了困難；傳統(tǒng)區(qū)域思想需要先驗(yàn)知識(shí)并對(duì)圖像有一定要求，且不考慮空間信息，容易造成過分割；而基于特殊算法的理論，則因?yàn)槠涮囟ǖ膽?yīng)用條件、復(fù)雜的參數(shù)或?qū)D像計(jì)算量的要求等，在FISH圖像的細(xì)胞核提取中并不適用。

　　2.2本文方法

　　綜合以上算法的優(yōu)缺點(diǎn)，本文考慮到像素點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)，選取馬爾科夫隨機(jī)場（MRF）［57］與無監(jiān)督的聚類算法相結(jié)合來進(jìn)行圖像分割，提取FISH圖像的細(xì)胞核。

　　從算法計(jì)算量和精度的角度考慮，在MRF建模中，選用二階8鄰域系統(tǒng)的Potts模型作為標(biāo)記場模型，有限高斯混合模型（FGMM）建立觀測場，迭代條件模式（ICM）作為最優(yōu)化分割算法，其中Potts模型中的勢(shì)函數(shù)β改進(jìn)為可變勢(shì)函數(shù)βb。

　　2.2.1可變勢(shì)函數(shù)

　　勢(shì)函數(shù)β的大小對(duì)分割結(jié)果影響很大。以圖4a為例進(jìn)行分割，選取其中β=0.5和β=5的情況，分割結(jié)果如圖4（b）和圖4（c）。

　　顯然，當(dāng)勢(shì)函數(shù)β增大時(shí)，標(biāo)記場就越占主導(dǎo)，區(qū)域性就越好，分割結(jié)果細(xì)節(jié)也就越差；當(dāng)勢(shì)函數(shù)β變小時(shí)，標(biāo)記場的影響就弱了，觀測場占的比重變大，分割結(jié)果細(xì)節(jié)信息豐富，區(qū)域性差。由此引入可變勢(shì)函數(shù)βb，符合“前期著重在區(qū)域性的控制，后期集中在細(xì)節(jié)信息的判斷”的規(guī)律，勢(shì)函數(shù)應(yīng)該是逐漸變小的。

　　綜上所述，設(shè)計(jì)可變勢(shì)函數(shù)如下：

　　令初始勢(shì)函數(shù)β=1，總迭代次數(shù)限制為maxIter，當(dāng)前迭代次數(shù)為Iter，則當(dāng)Iter<maxIter時(shí)，構(gòu)造可變勢(shì)函數(shù)βb，表達(dá)式為：

　　上式保證在迭代次數(shù)Iter增加時(shí)，勢(shì)函數(shù)βb是緩慢變小的，并且不會(huì)偏離最初由經(jīng)驗(yàn)確定的β值太多。

　　2.2.2FISH圖像細(xì)胞核的提取具體步驟

　　(1)將原始圖像轉(zhuǎn)化為藍(lán)色亮度圖;

　　(2)設(shè)定實(shí)驗(yàn)圖像分類數(shù)K=2，初始勢(shì)函數(shù)β=1，最大迭代次數(shù)maxIter=10；

　　(3)應(yīng)用Kmeans聚類算法得到初始分割；

　　(4)估計(jì)觀測場參數(shù)μ和σ2；

　　(5)計(jì)算FGMM模型建立的觀測場能量；

　　(6)計(jì)算Potts模型建立的標(biāo)記場能量；

　　(7)根據(jù)能量最小原則，估計(jì)新的分割；

　　(8)判斷是否滿足迭代終止條件（MAP準(zhǔn)則和最大迭代次數(shù)），滿足則算法停止，得到最佳分割，否則更新勢(shì)函數(shù)βb的值，并重新轉(zhuǎn)入步驟（3）。

　　2.2.3實(shí)驗(yàn)效果

　　分別用Otsu自動(dòng)閾值法、傳統(tǒng)的Kmeans聚類算法以及本文算法對(duì)FISH細(xì)胞圖像進(jìn)行分割，效果如圖5所示?？梢钥闯觯疚乃惴ū惹皟煞N產(chǎn)生的分割結(jié)果更加連續(xù)，且錯(cuò)判產(chǎn)生的孔洞現(xiàn)象更少。這說明：融合了MRF模型的Kmeans聚類分割方法，在兼顧了區(qū)域完整性的同時(shí)較好地保有了細(xì)節(jié)信息。而引入可變的勢(shì)函數(shù)βb的優(yōu)勢(shì)，在前文已有分析。在判定為細(xì)胞核的一些區(qū)域內(nèi)，仍然存在一些細(xì)小的孔洞，用前文處理暈染圖片時(shí)使用的方法修復(fù)，效果如圖6所示。

3粘連細(xì)胞核的分離

　　對(duì)粘連細(xì)胞核分離的常用方法主要依據(jù)三類原理，分別是：基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)、基于形狀特征以及特定理論的方法。

　　3.1傳統(tǒng)方法

　　當(dāng)目標(biāo)粘連緊密時(shí)，應(yīng)用基于數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的方法通常得不到理想的種子點(diǎn)個(gè)數(shù)。

　　基于形狀特征原理，主要是采用尋找凹點(diǎn)進(jìn)而分離的方法。將細(xì)胞核的粘連方式分為串聯(lián)和并聯(lián)兩類，根據(jù)每個(gè)區(qū)域凹點(diǎn)奇偶性或者其他準(zhǔn)則，來判斷屬于哪一類粘連。然后運(yùn)用不同的凹點(diǎn)匹配策略，進(jìn)行凹點(diǎn)連線劃分。但大部分的方法并沒有考慮更加復(fù)雜的串并聯(lián)混合情況，F(xiàn)ISH細(xì)胞核恰屬于復(fù)雜粘連情況，同時(shí)，F(xiàn)ISH細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，容易出現(xiàn)“假凹點(diǎn)”。

　　基于特定理論的方法中，比較適合FISH圖像復(fù)雜結(jié)構(gòu)的是文獻(xiàn)［8］中提出的基于水平集和隨機(jī)霍夫圓檢驗(yàn)方法來分離原生質(zhì)細(xì)胞核。但該算法融入了水平集算法，需要設(shè)定的參數(shù)非常多，隨著粘連細(xì)胞核個(gè)數(shù)的增加和粘連情況的復(fù)雜，相應(yīng)的參數(shù)也更加難以全面設(shè)置，并且需要用到統(tǒng)計(jì)學(xué)的霍夫投票法決定區(qū)域的分割歸屬問題，計(jì)算量較大，影響了總體分析效率，故不采用。此外，其他文獻(xiàn)中基于主動(dòng)輪廓模型［910］和圖論［1112］等方法的改進(jìn)，都因計(jì)算量比較大，不予采用。

　　3.2本文方法

　　在Harris和Susan算法的基礎(chǔ)上，改進(jìn)設(shè)計(jì)出“深度凹陷點(diǎn)”的檢測方法，尋找因粘連造成的真正凹陷，同時(shí)判斷出粘連現(xiàn)象的存在與否。接著，創(chuàng)新引入“自然凹陷力”的概念，令深度凹陷點(diǎn)的凹陷有規(guī)律有方向地加深，并逐漸產(chǎn)生區(qū)域斷裂，最終實(shí)現(xiàn)粘連的分離。

　　3.2.1深度凹陷點(diǎn)檢測

　　本文將角點(diǎn)分為以下4種點(diǎn)情況：鈍角凸點(diǎn)、銳角凸點(diǎn)、輕微凹陷點(diǎn)、深度凹陷點(diǎn)。本文定義的深度凹陷點(diǎn)必須滿足以下條件：以該角點(diǎn)作為圓形模板的中心，角點(diǎn)的兩條線段在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)構(gòu)成的夾角必須大于225°。

　　本文設(shè)計(jì)的深度凹陷檢測方法：

　?。?）設(shè)FISH細(xì)胞核二值圖I中，目標(biāo)（細(xì)胞核區(qū)域）標(biāo)記為1，背景標(biāo)記為0，同時(shí)構(gòu)造半徑R=5的圓形模板M，模板內(nèi)標(biāo)記為1的像素點(diǎn)總個(gè)數(shù)為MMAX；

　　（2）利用Harris角點(diǎn)檢測算法對(duì)I進(jìn)行掃描，得到一個(gè)角點(diǎn)集合J(j1,j2,...,jn)；

　　(3)將圓形模板M的中心與J(j1,j2,...,jn)逐點(diǎn)重合；

　　(4)借鑒Susan算法的思想，得到每一個(gè)角點(diǎn)位置上的USAN值MUSAN；

　　(5)當(dāng)MUSAN>5/8×MMAX時(shí)，該角點(diǎn)判定為深度凹陷點(diǎn)，存入集合H中，用于下一階段運(yùn)算。

　　3.2.2粘連判斷

　　當(dāng)某個(gè)目標(biāo)連通區(qū)域內(nèi)存在深度凹陷點(diǎn)時(shí)，該區(qū)域存在粘連現(xiàn)象，需要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離，否則是獨(dú)立細(xì)胞核。

　　3.2.3自然凹陷力

　　設(shè)想：在現(xiàn)實(shí)世界中，要讓這些粘連的細(xì)胞核產(chǎn)生分離，可以對(duì)每一個(gè)深度凹陷處施加作用力，要求該作用力的大小一致，方向順應(yīng)每個(gè)凹陷處的凹陷方向，這樣在凹陷處就會(huì)不斷地加深凹陷程度，粘連的細(xì)胞核們也會(huì)逐漸被擠壓得分離開。當(dāng)某幾處作用力匯集到一點(diǎn)時(shí)，該局部的粘連區(qū)域就被分離；當(dāng)圖像中所有深度凹陷處施加的作用力都匯集到某一處時(shí)，則粘連部分被完全分離。

　　為了滿足實(shí)時(shí)性的需求，本文采用純幾何的線性思想來模擬自然凹陷力的作用，如圖7所示。

　　本文設(shè)計(jì)的自然凹陷力具體作用過程為：

　?。?）取深度凹陷點(diǎn)集合H(H1,H2,...,Hn)；

　?。?）定位至其中一點(diǎn)Hi(i=1,2...,n)，以該點(diǎn)為圓心、R=8（多次實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)值）為半徑構(gòu)造一個(gè)圓，設(shè)該圓交Hi兩條邊的交點(diǎn)分別為J1和J2；

　　（3）作線段J1J2的中垂線（圖中HiHi′→所指的方向即為凹陷方向），在目標(biāo)內(nèi)交圓于Hi′點(diǎn)，將凹點(diǎn)Hi移動(dòng)至Hi′，則該凹陷局部區(qū)域的邊界，由原先的弧J1Hi⌒和弧HiJ2⌒，變?yōu)橛删€段J1Hi′和線段Hi′J2 構(gòu)成，實(shí)現(xiàn)該區(qū)域凹陷程度的加深；

　　(4)逐個(gè)定位至H中的其他點(diǎn)，重復(fù)步驟（2）和（3），遍歷一輪后，將產(chǎn)生的集合H′作為新的凹陷點(diǎn)集合H，完成一輪自然凹陷力作用；

　?。?）定位至更新過的Hi點(diǎn)，重復(fù)步驟（2）~（4），直至新產(chǎn)生的Hi′不再在目標(biāo)內(nèi)時(shí)，停止Hi點(diǎn)的繼續(xù)凹陷，跳至H中的其他點(diǎn)繼續(xù)操作，直至所有的H′都在背景中時(shí)（表示粘連產(chǎn)生的凹陷區(qū)域都完成分離），停止所有操作。

　　3.2.4本文粘連分離方法

　　(1)讀取一張?jiān)糉ISH細(xì)胞核圖Iy；

　　(2)利用前文設(shè)計(jì)的方法，將Iy分類并預(yù)處理為理想圖I，使用前文設(shè)計(jì)的細(xì)胞核提取方法，將I中的細(xì)胞核提取出來，并將圖像轉(zhuǎn)化為二值圖I0；

　　(3)對(duì)I0做邊界提取，記錄目標(biāo)初始邊緣ED0；

　　(4)利用半徑R=3的近圓形結(jié)構(gòu)元素SE，對(duì)I0圖像做腐蝕運(yùn)算，分離輕微粘連的細(xì)胞核；

　　(5)利用前文設(shè)計(jì)的“深度凹陷檢測方法”，檢測出當(dāng)前圖中深度凹陷點(diǎn)，存入集合H；

　　(6)利用前文“自然凹陷力”，逐點(diǎn)加深H點(diǎn)處的凹陷，最終使得細(xì)胞核粘連區(qū)域全部得以分離；

　　(7)對(duì)分離后的各個(gè)區(qū)域進(jìn)行連續(xù)粗化運(yùn)算（保持不連通性），使各個(gè)區(qū)域復(fù)原成原始大小，直至區(qū)域邊緣達(dá)到ED0的極限，且結(jié)果不再變化為止；

　　(8)對(duì)當(dāng)前二值圖I0做邊界提取，記錄當(dāng)前目標(biāo)的邊緣ED，則ED為細(xì)胞核的分離界線；

　　(9)將分離界線轉(zhuǎn)化為紅色，疊加于圖像I上，作為輸出結(jié)果。

　　3.2.5實(shí)驗(yàn)效果

　　分別選取“簡單粘連”和“復(fù)雜粘連”的FISH細(xì)胞核圖像進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8、圖9所示，實(shí)驗(yàn)效果理想。

4細(xì)胞核計(jì)數(shù)和信號(hào)點(diǎn)提取

　　4.1細(xì)胞核計(jì)數(shù)

　　讀取一張經(jīng)過粘連分離后的細(xì)胞核二值圖I0，繼而計(jì)算標(biāo)記為目標(biāo)（標(biāo)記為1）的連通區(qū)域數(shù)，即為細(xì)胞核個(gè)數(shù)。

　　4.2信號(hào)點(diǎn)提取

　　紅色信號(hào)點(diǎn)的提取方法：先將G和B的值減為0，得到R紅色熒光圖，再通過閾值分割和極限腐蝕法得到幾何中心，用于后續(xù)分析。同理，可用于綠色信號(hào)點(diǎn)的提取。

5結(jié)論

　　系統(tǒng)主要實(shí)現(xiàn)4個(gè)功能：（1）FISH圖像預(yù)處理；（2）FISH細(xì)胞核的提?。唬?）粘連細(xì)胞核的分離；（4）細(xì)胞核技術(shù)和信號(hào)點(diǎn)提取。上述設(shè)計(jì)，都在滿足精確度和視覺效果要求的范圍內(nèi)，盡可能構(gòu)造計(jì)算量小、直觀性強(qiáng)的方法。但仍存在著不足：無法實(shí)現(xiàn)某些特殊情況下的粘連分離，比如在細(xì)胞核嚴(yán)重團(tuán)簇、細(xì)胞核發(fā)生多層粘連時(shí)，內(nèi)層細(xì)胞核相互擠壓，沒有形成凹陷，使之無法分離。這有待進(jìn)一步改善。

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