摘 要： 對擬南芥的幼苗進行不同鹽濃度的處理，然后提取株系的RNA進行RNA-SEQ分析。為了能夠對這些基因數(shù)據(jù)進行精確的分析，將對擬南芥幼苗的基因數(shù)據(jù)進行兩步處理，首先對這些數(shù)據(jù)進行評估，包括對這些數(shù)據(jù)進行極差歸一化，做直方圖，使得對這些數(shù)據(jù)有大概的了解；然后提出了改進的主成分分析法的基因分析算法。改進的主成分分析法不僅包含了原始基因數(shù)據(jù)的全部信息，而且彌補了傳統(tǒng)主成分分析法的缺陷，可以處理數(shù)據(jù)的非線性特征，還反映了數(shù)據(jù)間的變異信息，使得數(shù)據(jù)的處理更加簡明、準確。結果表明，鹽脅迫對擬南芥DNA到RNA（即轉錄）的后期對RNA前體的加工方式沒有太大的影響。
0 引言
在生物信息學中，基因[1]和環(huán)境控制著生物的性狀，為了研究基因對生物的影響，先從擬南芥的幼苗中提取出來基因，然后對這些基因進行分析。因為幼苗受到鹽脅迫的程度不同，所以基因的多變量問題會頻繁出現(xiàn)，一旦變量增多，問題的復雜性和難度也會隨之增加，在實際問題中，這些變量之間也具有一定的關系。為了能夠從中選出少數(shù)的幾個指標，使它們盡可能地包含原始變量的所有信息，又可以達到用較少的指標去體現(xiàn)原來基因的信息，因此可以用主成分分析方法進行分析，它能夠比較客觀地反映樣本間的現(xiàn)實關系。
1 擬南芥幼苗的處理和基因的提取
1.1 擬南芥幼苗的處理
（1）對種子進行滅菌并且調制1/2MS培養(yǎng)基配方。
?。?）種完后，用封口膜包好，防止染菌。在4℃的冰箱中放置3天，然后放到培養(yǎng)箱中豎直培養(yǎng)7天，等長出2片真葉后，移到NaCl濃度為50 mM、200 mM的1/2MS培養(yǎng)基上。
（3）不作任何處理，50 mM和200 mM鹽濃度處理植株的取材時間分別為7天、48 h和12 h。
1.2 RNA的提取和RNA-SEQ檢測
對擬南芥幼苗進行3種條件處理：正常未處理（cd0）、50 mM鹽溶液處理（cd1）、200 mM鹽溶液[2]處理（cd5）。cd0取兩個株系，即cd0WT1、cd0WT2；cd1取3個株系：cd1WT0、cd1WT1、cd1WT2；cd5取3個株系cd5WT0、cd5WT1、cd5WT2。將上述株系提取它們的RNA送給公司進行RNA-SEQ數(shù)據(jù)分析。
因為DNA到RNA（即轉錄）的后期對RNA前體的加工方式（即剪接方式）的不同而造成了不同的剪接本，所以幼苗表現(xiàn)的性狀會有所不同。實驗對1 280條染色體上的基因進行了數(shù)據(jù)的分析，下面選一條擬南芥第5條染色體上的基因AT5G43280對實驗做全面的概述。AT5G43280這條基因匹配的數(shù)據(jù)最符合實驗生物最終結果，它有AT5G43280.1和AT5G43280.2兩種剪接本形式。
將提取到的RNA通過技術轉換成cDNA，這些cDNA被隨機打碎成90 bp的片段，將大批量的隨機打碎的片段（每個株系從192段到400片段不等）與AT5G43280.1和AT5G43280.2進行對比，計算出僅與AT5G43280.1匹配的基因片段所占比率、僅包含在AT5G43280.2的比率以及同時包含在這兩種基因的片段的比率，通過對數(shù)據(jù)進行分析做出數(shù)據(jù)的表格如表1所示，極差歸一化和直方圖如圖1所示。
表1中，0代表打亂的每一個90 bp與AT5G43280.1和AT5G43280.2都不匹配；1代表只存在于AT5G43280.1的片段數(shù)；2代表只存在于AT5G43280.2的片段數(shù)；3代表既包含在AT5G43280.1，又存在于AT5G43280.2中的片段數(shù)。
從AT5G43280數(shù)據(jù)分析可以得出：對未處理的（cd0）的擬南芥DNA到RNA（即轉錄[3-4]）的后期對RNA前體的加工方式大部分是AT5G43280.1剪接本形式，50 mM鹽處理（cd1）、200 mM鹽處理（cd5）的擬南芥DNA到RNA（即轉錄）的后期對RNA前體的加工方式大部分為AT5G43280.1剪接本形式。通過對這些基因數(shù)據(jù)進行分析得出：鹽脅迫對擬南芥DNA到RNA（即轉錄）的后期對RNA前體的加工方式沒有太大的影響。
2 利用改進的主成分分析方法對基因數(shù)據(jù)再次進行分析
在實際應用中，為了消除變量量綱的影響，往往對原始數(shù)據(jù)標準化，但是標準化在消除量綱或數(shù)量級影響的同時，也抹殺了各指標變異程度的差異信息。傳統(tǒng)的主成分分析法[5]基于相關系數(shù)矩陣進行數(shù)據(jù)標準化處理，將數(shù)據(jù)間方差化為1，消除了數(shù)據(jù)量綱[6]和數(shù)據(jù)級影響的同時，也忽略了數(shù)據(jù)指標間的變異程度。因此本文采用中心化對數(shù)比進行原始數(shù)據(jù)變換。
2.1 改進的主成分分析方法步驟
?。?）假定有n個樣本，每個樣本共有p個變量，構成一個n×p階的數(shù)據(jù)矩陣X。
?。?）對數(shù)變換法
采用中心化對數(shù)比進行原始數(shù)據(jù)變換，一是可以處理數(shù)據(jù)的非線性特征，二是可以充分反映數(shù)據(jù)間的變異性信息。
yij=lnxij（1）
?。?）求解主成分
求解主成分時可以從樣本協(xié)方差矩陣出發(fā)，也可以從樣本相關系數(shù)矩陣出發(fā)。
計算相關系數(shù)矩陣：
R=r11 r12 L r1pr21 r22 L r2pM M L Mrp1 rp2 L rpp
其中，rij（i，j=1，2，3，…，p）為變量yi與yj的相關系數(shù)，rij=rji其計算公式為：
?。?）計算特征值[7]與特征向量
?、俳馓卣鞣匠蘾λI-R|=0，求出特征值，并使其按大小順序排列（λ1≥λ2≥λ3…λP≥0），分別求出對應于特征值λi的特征向量。
?、谟嬎阒鞒煞重暙I率[8]及累計貢獻率。
貢獻率：
累計貢獻率：
累積貢獻率[9]反映了前m個主成分綜合原始變量信息的能力，通常是取較小的m，而且累積貢獻率自達到一定的數(shù)值（85%）時，累積方差貢獻率越大，這就表示前面的幾個主成分包含的信息就越豐富。對于含有m個主成分的數(shù)據(jù)來說，每一個主成分都可以表示為：
fi=ei1z1+ei2z2+…+eizzp（i=1，2，3，…，m）
因此綜合評價為：
2.2 主成分的指標分成強、中、弱三部分
在對基因的分析中發(fā)現(xiàn)，各列（指標）之間的相關性高低影響著評價指標權重系數(shù)的分配，權重系數(shù)會明顯地傾向于相關系數(shù)較高的變量，不同的研究者使用的評價標準不同，得到的結果也會有差距。又因為在不同鹽濃度處理下幼苗提取的基因的數(shù)據(jù)量大，為了使最后得到的綜合評價函數(shù)能夠合理，可以把主成分的指標分成強、中、弱3部分，將相關性較強的指標分入到s1中，相關性較弱的指標分入到s2，剩下的分到相關性為中的s3中，s1+s2+s3=A（A為基因數(shù)據(jù)指標元素總體），所以相關性較強的指標得到函數(shù)f11，相關性為中的指標得到函數(shù)f22，相關性較弱的指標得到函數(shù)f33（在這3項中指標個數(shù)不一定相同），最終的綜合函數(shù)為：F=f11+f22+f33。
3 實例分析
實驗對擬南芥很多條染色體上面的基因作了研究，對從這些植株中提取的數(shù)據(jù)進行分析，目的是探討用不同濃度的鹽處理擬南芥幼苗，是否對DNA到RNA的轉錄方式有變化，導致擬南芥幼苗外形的變化。
?。?）首先對這些數(shù)據(jù)采用中心化對數(shù)比進行原始數(shù)據(jù)變換，然后利用MATLAB求出數(shù)據(jù)的相關系數(shù)矩陣R：
從計算出的相關系數(shù)矩陣可以看出，第1列、第2列、第4列的相關性比較強，第6列、第7列、第8列的相關性為中，第3列和第5列之間的相關性最弱。根據(jù)相關性強弱將它們分到s1，s2，s3中。求出R的特征值、差值、特征向量、貢獻率和累積貢獻率，進而求得主成分與變量之間的關系如表2所示。
第一主成分對所有主成分的貢獻率為76.389 5%，而01所占的比重最大，因指標1表示由DNA到RNA的轉錄方式選擇的是第一種剪接本，因此標準變化量為0、1、3時，這3個指標值比較大時，第一主成分的貢獻率也就越大。第二主成分對所有主成分的貢獻率為 17.155 0%，而2所占的比重比較大，指標2表示的是DNA到RNA的轉錄方式選擇的是第二種剪接本，因此標準變化量為0、1、2、7時，這4個指標值比較大，第二主成分的貢獻率也就越大。前兩個主成分的累積貢獻率達到了93.544 5%，因此可以只用前3個主成分進行后續(xù)的分析，后面主成分對總體的貢獻率比較小，分別為5.6%、0.6%和0.1%，可以不對它們做出任何解釋。
第一主成分分量的計算公式為：
f1=0.369 5z1+0.4z2+0.050 2z3+0.612 6z4-0.230 2 z6-0.522 2z8
第二主成分分量的計算公式為：
f2=0.336 9z1+0.248 8z2+0.666 8z3+0.139 0z4+0.253 1z6+0.544 6z8
綜合評價函數(shù)為：F=a1f1+a2f2+…+amfm
F=0.34z1+0.348 2z2+0.114 3z3+0.491 7z4-0.132 3z6-0.305 4z8
又因為把主成分的指標分為強、中、弱3部分，所以最終的綜合評價函數(shù)為F=f11+f22+f33。由f11=0.369 5z1+ 0.4z2+0.612 6z4，f22=0.050 2z3，f33=-0.230 2z6-0.522 2z8，可得：
F=0.369 5z1+0.4z2+0.050 2z3+0.612 6z4-0.230 2z6-0.522 2z8
由綜合函數(shù)可以得到，s1中包含的指標0、1、3的相關性較強，改進的主成分分析方法使得相關性較強的集合更加明顯，相關性較弱的集合相應地減弱，更容易分析鹽脅迫對擬南芥基因的影響。由于0、1、3指標的意義，明顯可以得到不同的鹽濃度下DNA到RNA的轉錄方式基本都是選擇第一種剪接本，擬南芥的幼苗在濃度越高的環(huán)境下生長的葉子黃而且小，主要是外界環(huán)境的作用，鹽濃度對基因的改變不大。
4 結論
主成分分析方法在很多領域得到廣泛的應用，一般來說，當研究的問題涉及很多變量時，變量間相關性明顯，并且包含的信息有所重疊時，可以考慮用主成分分析方法。本文經過對PCA進行改進，更容易抓住事物的主要矛盾，使問題得到解決，通過對擬南芥基因數(shù)據(jù)的分析，預測的結論和實驗得到的結果一致。在實際的評價中，應當從樣本的客觀性出發(fā)，兼顧主觀客觀兩方面，分析不同的數(shù)據(jù)應當使用不同的PCA改進方法，以達到所需要的目的，并且能夠更加準確地分析數(shù)據(jù)。
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