《電子技術(shù)應(yīng)用》
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一種基于ATP微生物檢測儀的設(shè)計與實現(xiàn)
2015年電子技術(shù)應(yīng)用第4期
張健偉1,鐘冠明1,吳清平2,李程思2
1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,廣東 廣州510063; 2.廣東省微生物研究所,廣東 廣州510070
摘要: 介紹了一種基于三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光原理的微生物含量檢測方法,并利用這種方法設(shè)計了一種檢測儀的軟硬件系統(tǒng)。其中主要采用光電倍增管以及外部放大處理電路將ATP光信號轉(zhuǎn)換為電脈沖信號,然后利用微控制器進行脈沖計數(shù)從而計算出待測物體中的ATP的濃度,通過μC/OS-II實時操作系統(tǒng)以及μC/GUI圖形庫將結(jié)果實時地顯示在觸摸屏上,并同時保存在外部microSD卡中。最后對系統(tǒng)進行了詳細測試并給出了相關(guān)數(shù)據(jù)。
中圖分類號: TM93
文獻標(biāo)識碼: A
文章編號: 0258-7998(2015)04-0063-06
Design and implementation of an ATP-based microorganism detector
Zhang Jianwei1,Zhong Guanming1,Wu Qingping2,Li Chengsi2
1.Guangdong Huankai Microbial Sci.& Tech. Co.,Ltd.,Guangzhou 510063,China; 2.Guangdong Institute of Microbiology,Guangzhou 510063,China
Abstract: This paper introduces a method to measure the content of microorganism adopting adenosine-triphosphate(ATP) bioluminescence principle, based on which the hardware and software system of a detector is designed. It mainly uses photomultiplier and external amplifier circuit to convert ATP optic signal to electric pulse signal, the micro-controller then calculates out the concentration of ATP in the object by pulse counting. The result is displayed on the touch screen in real time through μC/OS-II real-time operating system and μC/GUI graphics library. At meantime the result is stored in external microSD card. The system finally carries thorough tests and comes up with relevant data.
Key words : adenosine-triphosphate(ATP);photomultiplier;MCU;HMI

  

0 引言

  目前,食品安全問題日益突出,如何快速檢測食品中微生物是否達標(biāo)是國內(nèi)外食品微生物檢測人員共同關(guān)注的焦點。傳統(tǒng)的食品衛(wèi)生達標(biāo)檢測方法采用基于細菌培養(yǎng)的平皿法,該方法及結(jié)果得到各種標(biāo)準(zhǔn)的認可,但是這種細菌培養(yǎng)的方法具有一定的局限性,如:不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法只適合檢測特定的微生物,如霉菌、厭氧菌、藻類等均有特定的檢測方法,此外培養(yǎng)法影響結(jié)果的人為因素較多,操作周期長達1~5天。簡而言之,傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測微生物存在檢測效率較低、驗證周期長、培養(yǎng)條件多樣、難以多種菌類品種同時檢測等諸多限制,難以適應(yīng)衛(wèi)生檢驗機構(gòu)對食品中微生物快速檢測的需求。

  本文主要闡述一種基于ATP生物發(fā)光原理測定微生物含量的方法(即ATP檢測技術(shù)[1]),介紹了該系統(tǒng)的軟、硬件平臺的設(shè)計原理,通過采用生化反應(yīng)、傳感器和電子系統(tǒng)相結(jié)合的方法,實現(xiàn)對溶液中細菌數(shù)量的檢測,最后給出了詳細的測試數(shù)據(jù)和分析結(jié)果。

  該微生物檢測儀具有檢測周期短、操作簡易等優(yōu)點,可在許多領(lǐng)域替代傳統(tǒng)測試方法,從而大大提高效率,為食品安全提供堅實的保障。

  1 系統(tǒng)硬件設(shè)計與實現(xiàn)


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  系統(tǒng)硬件框圖如圖1所示。系統(tǒng)從信號采集模塊得到源信號,經(jīng)過微控制器模塊的處理和控制后,最終將結(jié)果在觸摸屏上顯示并存儲。

  微控制器模塊采用了STM32F407。光電倍增管、電壓放大器、電壓比較器構(gòu)成了信號采樣模塊。高壓模塊為光敏器件提供高壓電源。電機模塊主要為黑暗測試環(huán)境提供一道門禁,并用光電傳感器監(jiān)測門禁是否正常開關(guān),形成反饋機制。用戶界面選取觸屏的交互方式,方便用戶操作和界面定制。存儲模塊由microSD卡上搭建文件系統(tǒng),供PC機查看存儲的歷史記錄。

  1.1 電源模塊

  系統(tǒng)采用7組電源供電,如圖2所示。

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  當(dāng)無外接電源時,由內(nèi)置12 V蓄電池供電,接入外部電源后,將對蓄電池進行充電;待蓄電池充滿電后,將借助二極管斷開蓄電池的對外供電通路,以延長蓄電池壽命。

  1.2 微控制器模塊

  本系統(tǒng)采用意法半導(dǎo)體的STM32F407微處理器。該微處理器為32 bit、ARM cortex-M4核、主頻可達168 MHz,提供210 DMIPS的運算能力,具有1MB的可編程閃存(Flash)和192 KB的SRAM。系統(tǒng)使用到的MCU外設(shè)功能包括:

  TIMER輸入捕獲采樣脈沖信號;DAC調(diào)節(jié)輸出電壓,ADC監(jiān)控高壓模塊輸出電壓反饋;TIMER PWM輸出控制電機模塊;FSMC總線輸出數(shù)據(jù)到顯示屏,SPI總線接收觸摸輸入信號;SDIO總線與microSD卡通信,讀寫歷史記錄和配置參數(shù);USB與PC機進行MassStorage類通信。

  1.3 信號采樣模塊

  信號采樣模塊采用光電倍增管采集微生物發(fā)光強度,并轉(zhuǎn)化為微弱電脈沖信號。該電脈沖信號是整個系統(tǒng)的信號源頭,后續(xù)的信號處理、顯示以及存儲都針對該核心信號源進行運算分析。因此光電傳感器的選擇、放大整形電路的設(shè)計以及信號捕獲方式的選擇是系統(tǒng)硬件設(shè)計中的重中之重。

  1.3.1 光電倍增管

  由于微生物發(fā)光微弱、短暫、穩(wěn)定性差、發(fā)光曲線呈類拋物線型且信號易被淹沒,故本設(shè)計采用端窗式光電倍增管,它具有高信噪比、高靈敏度和高穩(wěn)定性特點,可最大程度地滿足對微生物采光的需求。

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  光電倍增管內(nèi)部構(gòu)造示意圖如圖3所示,光電倍增管的光電陰極和陽極之間還放置多個瓦形倍增電極,使用時相鄰兩倍增電極間均加高壓。光電陰極受光照后釋放出光電子,在電場作用下射向第一倍增電極,引起電子的二次發(fā)射,激發(fā)出更多的電子,然后在電場作用下飛向下一個倍增電極,再次激發(fā)出更多的電子。如此電子數(shù)不斷倍增,陽極最后收集到的電子可增加 104~108倍,這使光電倍增管的靈敏度比普通光電管要高得多,可用來檢測微弱光信號[2]。

  生物發(fā)光的亮度范圍是10-17~10-7 mol/cell,波長為300 nm~600 nm之間,系統(tǒng)需要的光電倍增管必須對照此范圍來確定型號。圖4給出了所選用的光電倍增管光譜響應(yīng)特性曲線,從中可以看出光電倍增管轉(zhuǎn)換效率(陰極靈敏度)隨入射光波長的變化改變[4],其波長測量范圍包含300 nm~600 nm區(qū)間,且在420 nm處靈敏度最高,適合本系統(tǒng)需求。

  該光電倍增管屬于脈沖型倍增管,它適用于光強不大的場合,可將采集到的微弱光信號轉(zhuǎn)化為微弱電脈沖信號。由于微生物發(fā)光強度非常低,在0~106個光子級別,所以倍增管的輸出電壓大小為微伏到毫伏級別,需要外部電路進行放大。

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  外部處理采用CC228P作為光電管的高壓電源,光電倍增管輸出微弱的電脈沖信號,經(jīng)過AD603構(gòu)成的電壓放大器放大,以及電壓比較器整形,電路最終輸出了幅度在0~3.3 V之間的標(biāo)準(zhǔn)脈沖。

  電路輸出的標(biāo)準(zhǔn)脈沖的寬度為2.5 ns,頻率隨脈沖數(shù)的大小而變化,最大頻率范圍約為10 MHz。ATP濃度不同時,光電倍增管輸出脈沖示意圖如圖5所示。

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  1.3.2 MCU定時器輸入捕獲

  由于光電倍增管產(chǎn)生的電脈沖在1 Hz~12.5 MHz,頻率較高,故采用STM32定時器的輸入捕獲計數(shù)法。軟件配置好定時器捕獲模式后,定時器便進入硬件工作,從而有效提高處理器的工作效率。

  信號采樣模塊使用了輸入捕獲模式以測量脈沖頻率。當(dāng)檢測到TIM1_CH1上出現(xiàn)下降沿時,計數(shù)器當(dāng)前值TIM1_

  CNT加1,存入捕獲比較寄存器TIM1_CCR1中,完成一次捕獲。當(dāng)達到設(shè)定閾值(65535溢出),則發(fā)生捕獲中斷,進入中斷處理函數(shù),自定義的整形couter自增1。TIM2每1 s進一次中斷,讀取TIM1中的couter和TIM1_CNT,則這1 s的脈沖數(shù)為:conter65535+TIM1_CNT。

2 系統(tǒng)軟件設(shè)計與實現(xiàn)

  微生物檢測系統(tǒng)軟件部分的設(shè)計與實現(xiàn),涉及功能實現(xiàn)和交互設(shè)計兩大任務(wù)。鑒于本系統(tǒng)功能需求較為復(fù)雜,觸摸界面與控件繁多,需要存儲用戶配置和歷史記錄,并在PC機上以文件形式讀寫,本系統(tǒng)選擇采用μC/OS-II+μC/GUI+FatFS+USB的軟件結(jié)構(gòu)作為中間件,其通用的上下層接口,便于編寫規(guī)范的程序以及后續(xù)升級。本章主要圍繞中間件移植和應(yīng)用層實現(xiàn)兩方面展開詳細介紹。

  2.1 中間層詳細介紹

  系統(tǒng)軟件架構(gòu)設(shè)計的目標(biāo)從微觀上講,需要實現(xiàn)控件對應(yīng)功能,以及界面的狀態(tài)切換?;谏鲜鲆?,系統(tǒng)軟件圍繞軟件結(jié)構(gòu)大致可分為三層:底層硬件驅(qū)動程序,中間層OS、GUI、文件系統(tǒng)以及上層應(yīng)用層用戶程序。

  本系統(tǒng)中間層包括μC/OS-II、μC/GUI、FatFS和USB協(xié)議,下面介紹上述模塊的移植以及應(yīng)用層調(diào)用接口。

  2.1.1 μC/OS-II移植

  μC/OS-II是一個廣泛應(yīng)用于微控制器的實時操作系統(tǒng)內(nèi)核,它包含了任務(wù)調(diào)度、任務(wù)管理、事件管理、內(nèi)存管理和任務(wù)間的通信與同步等基本功能,但是沒有提供輸入/輸出管理、文件系統(tǒng)、網(wǎng)絡(luò)等額外的服務(wù)[5],所以本系統(tǒng)圖形用戶界面和文件系統(tǒng)都需要單獨移植。

 ?。?)μC/OS-II軟件體系結(jié)構(gòu)

  μC/OS-II軟件架構(gòu)主要包括以下5大模塊:應(yīng)用程序、μC/OS-II內(nèi)核代碼、μC/OS-II與硬件相關(guān)的代碼、BSP層、Cortex-M4內(nèi)核。其中需要自行編寫的主要是應(yīng)用程序,移植時需要修改與硬件相關(guān)的代碼,其余部分基本可以沿用μC/OS-II的開源代碼。

  (2)實時操作系統(tǒng)μC/OS-II內(nèi)核移植

  在移植過程中,需要修改的軟件主要是與處理器相關(guān)的3個文件,包括設(shè)置庫文件OS_CPU中與處理器和編譯器相關(guān)的代碼,用C語言編寫的6個與操作系統(tǒng)相關(guān)的函數(shù)C文件,用匯編語言編寫的4個與處理器相關(guān)的函數(shù)匯編文件。需改寫OS_CPU.H、OS_CPU.C、OS_CPU_

  A.ASM、startup_stm32f4xx.s、os_cpu_a.asm.s文件[6]。

  2.1.2 μC/GUI移植

  Micrium公司開發(fā)的μC/GUI是一種通用嵌入式應(yīng)用的圖形界面軟件,它可為任何使用LCD圖形顯示的應(yīng)用提供一套高效的獨立于處理器及LCD控制器而設(shè)計的圖形用戶接口,適用于單任務(wù)或是多任務(wù)系統(tǒng)環(huán)境,通常和μC/OS-II結(jié)合使用。

  本系統(tǒng)采用μC/GUI 3.90a版本,該版本優(yōu)點是移植時需要改動的地方少,LCD底層驅(qū)動獲取方便,不依賴于μC/GUI官方驅(qū)動。

  μC/GUI系統(tǒng)移植主要涉及底層驅(qū)動配置文件,為了適用個性化的LCD、LCD控制器以及觸摸屏硬件,主要需要修改LCDConf.h、GUIConf.h、LCD底層驅(qū)動這3個文件。

  2.1.3 USB驅(qū)動

  由于USB總線具有通用性、穩(wěn)定性、便利性、高傳輸速率等良好特性[7],系統(tǒng)選擇USB總線協(xié)議實現(xiàn)上下位機通信。根據(jù)系統(tǒng)需求,選用USB2.0規(guī)范,運行在全速模式(12 Mb/s)下,PC機作為主機,本系統(tǒng)作為設(shè)備。

  2.2 應(yīng)用層詳細介紹

  應(yīng)用層軟件按系統(tǒng)功能需求分為5大模塊:數(shù)據(jù)采集與處理、參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)校正、人機交互和歷史數(shù)據(jù)查詢。

  系統(tǒng)上電后首先初始化各硬件模塊,一切正常之后進入用戶界面。用戶界面可設(shè)置為英文或中文顯示。在主菜單界面中點擊相應(yīng)控件可進入下一級界面,包括:基本測試、測試選擇、測試設(shè)定、測試歷史。

  進行測量時,應(yīng)首先選定序號,默認為上次操作時選擇的序號。測量方式可設(shè)定為基本測試或平均測試?;緶y試時需要自定義等待時間、測試時長。平均測試則需要自定義等待時間、測試時長和平行個數(shù)。

  在GUI中,使用GUI_WIDGET_CREATE_INFO結(jié)構(gòu)體表示各個界面,用于存放界面中的控件種類、數(shù)量、ID,結(jié)構(gòu)體原型如下:

  struct GUI_WIDGET_CREATE_INFO_struct

  {

  GUI_WIDGET_CREATE_FUNC* pfCreateIndirect;

  const char* pName;/*控件指針*/

  I16 Id;/*ID號,在對話框中唯一標(biāo)示*/

  I16 x0,y0,xSize,ySize;/*定義位置和大小*/

  U16 Flags;/*控件的特殊創(chuàng)建標(biāo)志(可選)*/

  I32 Para;/*控件的特殊參數(shù)(可選)*/

  }

  界面消息回調(diào)函數(shù)在發(fā)生事件時將被自動調(diào)用,并根據(jù)發(fā)生事件的ID進入相應(yīng)分支進行處理:static void _cbCallback_xxx (WM_MESSAGE* pMsg)。

3 測試與總結(jié)

  本系統(tǒng)在研發(fā)過程中進行了大量前中期測試,為系統(tǒng)軟硬件設(shè)計和調(diào)整提供了大量依據(jù)。以下將展示系統(tǒng)開發(fā)階段的測試結(jié)果,并給出系統(tǒng)功能與性能測試報告。

  3.1 仿真測試

  理論上,供給生物發(fā)光的ATP含量范圍為0~10-8 mol,對應(yīng)的RLU脈沖頻率范圍是0~8 MHz。在后端數(shù)字系統(tǒng)的開發(fā)階段,可以借助頻率發(fā)生器產(chǎn)生電脈沖信號來模擬RLU,用以測試后端系統(tǒng)對不同頻率脈沖的處理能力,且該頻率精確穩(wěn)定,可以消除外部因素的干擾[3]。表1列出了測試結(jié)果,數(shù)據(jù)表明STM32F407的定時器模塊可以檢測到0 Hz~12.5 MHz的矩形脈沖,超出12.5 MHz后,計數(shù)值達到瓶頸,無法繼續(xù)往上計數(shù)。由于實物RLU值主要范圍在0~8 MHz,而且對于超出范圍的樣液,可以通過稀釋的辦法使其ATP的值下降到計數(shù)范圍內(nèi)。

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  由表1可見,采用定時器硬件計數(shù)捕獲輸入法測定的誤差在個位數(shù)范圍內(nèi),也在本系統(tǒng)允許誤差范圍內(nèi),證明定時器硬件計數(shù)設(shè)計是合理的,適合系統(tǒng)需求。

  3.2 試劑實物測試

  本系統(tǒng)整機測試流程為:開機自檢校正、取樣、混合、測量、讀數(shù),如表2所示。

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  光電倍增管需要高壓供給,其供電電壓應(yīng)跟隨靈敏度而改變。若電壓太高,增益噪聲呈倍數(shù)增長,會影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性;若電壓太低,檢測不出低含量的微生物。為此可通過調(diào)節(jié)供電電壓,尋找合適的靈敏度。表3列出了在不同電壓下,光電倍增管捕獲光子數(shù),即RLU值。

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  從表3可以看出,樣機在電壓調(diào)至850 V以上出現(xiàn)噪聲,1 310 V以內(nèi)噪聲RLU小于20;電壓越大時,儀器靈敏度越高,本系統(tǒng)選用1 250 V為常態(tài)下測量電壓,如果靈敏度太高,噪聲將影響測試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。使用者可以根據(jù)待測品的性質(zhì),在測試前進入調(diào)試界面調(diào)整輸入電壓。

  對不同濃度的待測品,0.5 mL體系下的線性與靈敏度測試結(jié)果如表4所示。

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  檢測靈敏度為10-14 mol ATP,在測試范圍內(nèi)有近線性關(guān)系。ATP含量若低于10-14 mol的級別,本儀器無法精準(zhǔn)測量。

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  在0.5 mL體系下的線性與靈敏度曲線如圖6所示。

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  0.3 mL體系下的線性與靈敏度測試結(jié)果見表5。

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  0.3 mL體系下的線性與靈敏度曲線見圖7。

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  樣機變壓電源可調(diào)電壓上限為1 310 V,在測試范圍內(nèi),電壓與RLU成正比。以中等發(fā)光試劑測試,最高檢測靈敏度為ATP 10-18 mol,但在ATP濃度低于10-16 mol時,可信度較低(重復(fù)性差)。

  在測試范圍內(nèi),ATP的量與RLU有較好的線性關(guān)系,線性拐點出現(xiàn)在ATP10-14 mol~10-15 mol之間;在可調(diào)電壓范圍內(nèi),空機噪聲低于30 RLU,通常在10~25之間上下波動[10]。

  本系統(tǒng)測試所用樣液為標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液,向該溶液滴入熒光素酶,ATP能量定量轉(zhuǎn)換為光能,所以該系統(tǒng)在交付時,除了儀器本身以外,還需要配套化學(xué)試劑。本系統(tǒng)采用廣東省微生物研究所研制的發(fā)光試劑盒,可在各類水、飲料和相關(guān)食品中應(yīng)用,一次測量在30 s以內(nèi),整個測量過程不到30 min。測試結(jié)果與美國儀器對比,在可測量范圍內(nèi)結(jié)果相近,且穩(wěn)定、重復(fù)性高。

  表6給出了本儀器的性能指標(biāo)。

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  最后,對本儀器的相關(guān)性能與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法進行了比較,如表7所示。

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4 總結(jié)

  從測試數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),ATP含量和細胞數(shù)、發(fā)光值RLU都存在線性關(guān)系,測定熒光信號的強度,便可得知待檢目標(biāo)被細菌、食物殘渣等污染的程度,因此檢測ATP可以作為判斷食物潔凈的指標(biāo)。

  系統(tǒng)基本符合預(yù)定的設(shè)計目標(biāo)和效果,可快速檢測樣品中微生物含量,具有測定周期短、效率高、判斷標(biāo)準(zhǔn)清晰以及測量范圍寬(10-7 mol~10-16 mol)等特點。

  同時,與傳統(tǒng)的檢測方法相比,基于測量ATP濃度來間接確定微生物含量的方法能滿足測試覆蓋率高達80%以上的微生物種類,可廣泛應(yīng)用于政府監(jiān)督部門、第三方檢測機構(gòu)、食品加工行業(yè)、食品和原材料分銷商、飯店、賓館食品操作間、醫(yī)院等領(lǐng)域。

  參考文獻

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