0 引言

　　目前，食品安全問題日益突出，如何快速檢測食品中微生物是否達(dá)標(biāo)是國內(nèi)外食品微生物檢測人員共同關(guān)注的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)的食品衛(wèi)生達(dá)標(biāo)檢測方法采用基于細(xì)菌培養(yǎng)的平皿法，該方法及結(jié)果得到各種標(biāo)準(zhǔn)的認(rèn)可，但是這種細(xì)菌培養(yǎng)的方法具有一定的局限性，如：不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法只適合檢測特定的微生物，如霉菌、厭氧菌、藻類等均有特定的檢測方法，此外培養(yǎng)法影響結(jié)果的人為因素較多，操作周期長達(dá)1~5天。簡而言之，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測微生物存在檢測效率較低、驗(yàn)證周期長、培養(yǎng)條件多樣、難以多種菌類品種同時(shí)檢測等諸多限制，難以適應(yīng)衛(wèi)生檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)對食品中微生物快速檢測的需求。

　　本文主要闡述一種基于ATP生物發(fā)光原理測定微生物含量的方法(即ATP檢測技術(shù)[1])，介紹了該系統(tǒng)的軟、硬件平臺的設(shè)計(jì)原理，通過采用生化反應(yīng)、傳感器和電子系統(tǒng)相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)對溶液中細(xì)菌數(shù)量的檢測，最后給出了詳細(xì)的測試數(shù)據(jù)和分析結(jié)果。

　　該微生物檢測儀具有檢測周期短、操作簡易等優(yōu)點(diǎn)，可在許多領(lǐng)域替代傳統(tǒng)測試方法，從而大大提高效率，為食品安全提供堅(jiān)實(shí)的保障。

　　1 系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

　　系統(tǒng)硬件框圖如圖1所示。系統(tǒng)從信號采集模塊得到源信號，經(jīng)過微控制器模塊的處理和控制后，最終將結(jié)果在觸摸屏上顯示并存儲。

　　微控制器模塊采用了STM32F407。光電倍增管、電壓放大器、電壓比較器構(gòu)成了信號采樣模塊。高壓模塊為光敏器件提供高壓電源。電機(jī)模塊主要為黑暗測試環(huán)境提供一道門禁，并用光電傳感器監(jiān)測門禁是否正常開關(guān)，形成反饋機(jī)制。用戶界面選取觸屏的交互方式，方便用戶操作和界面定制。存儲模塊由microSD卡上搭建文件系統(tǒng)，供PC機(jī)查看存儲的歷史記錄。

　　1.1 電源模塊

　　系統(tǒng)采用7組電源供電，如圖2所示。

　　當(dāng)無外接電源時(shí)，由內(nèi)置12 V蓄電池供電，接入外部電源后,將對蓄電池進(jìn)行充電；待蓄電池充滿電后,將借助二極管斷開蓄電池的對外供電通路，以延長蓄電池壽命。

　　1.2 微控制器模塊

　　本系統(tǒng)采用意法半導(dǎo)體的STM32F407微處理器。該微處理器為32 bit、ARM cortex-M4核、主頻可達(dá)168 MHz，提供210 DMIPS的運(yùn)算能力，具有1MB的可編程閃存（Flash）和192 KB的SRAM。系統(tǒng)使用到的MCU外設(shè)功能包括：

　　TIMER輸入捕獲采樣脈沖信號；DAC調(diào)節(jié)輸出電壓，ADC監(jiān)控高壓模塊輸出電壓反饋；TIMER PWM輸出控制電機(jī)模塊；FSMC總線輸出數(shù)據(jù)到顯示屏，SPI總線接收觸摸輸入信號；SDIO總線與microSD卡通信，讀寫歷史記錄和配置參數(shù)；USB與PC機(jī)進(jìn)行MassStorage類通信。

　　1.3 信號采樣模塊

　　信號采樣模塊采用光電倍增管采集微生物發(fā)光強(qiáng)度，并轉(zhuǎn)化為微弱電脈沖信號。該電脈沖信號是整個(gè)系統(tǒng)的信號源頭，后續(xù)的信號處理、顯示以及存儲都針對該核心信號源進(jìn)行運(yùn)算分析。因此光電傳感器的選擇、放大整形電路的設(shè)計(jì)以及信號捕獲方式的選擇是系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)中的重中之重。

　　1.3.1 光電倍增管

　　由于微生物發(fā)光微弱、短暫、穩(wěn)定性差、發(fā)光曲線呈類拋物線型且信號易被淹沒，故本設(shè)計(jì)采用端窗式光電倍增管，它具有高信噪比、高靈敏度和高穩(wěn)定性特點(diǎn)，可最大程度地滿足對微生物采光的需求。

　　光電倍增管內(nèi)部構(gòu)造示意圖如圖3所示，光電倍增管的光電陰極和陽極之間還放置多個(gè)瓦形倍增電極，使用時(shí)相鄰兩倍增電極間均加高壓。光電陰極受光照后釋放出光電子，在電場作用下射向第一倍增電極，引起電子的二次發(fā)射，激發(fā)出更多的電子，然后在電場作用下飛向下一個(gè)倍增電極，再次激發(fā)出更多的電子。如此電子數(shù)不斷倍增，陽極最后收集到的電子可增加 104～108倍，這使光電倍增管的靈敏度比普通光電管要高得多，可用來檢測微弱光信號[2]。

　　生物發(fā)光的亮度范圍是10-17～10-7 mol/cell，波長為300 nm～600 nm之間，系統(tǒng)需要的光電倍增管必須對照此范圍來確定型號。圖4給出了所選用的光電倍增管光譜響應(yīng)特性曲線，從中可以看出光電倍增管轉(zhuǎn)換效率(陰極靈敏度)隨入射光波長的變化改變[4]，其波長測量范圍包含300 nm～600 nm區(qū)間，且在420 nm處靈敏度最高，適合本系統(tǒng)需求。

　　該光電倍增管屬于脈沖型倍增管，它適用于光強(qiáng)不大的場合，可將采集到的微弱光信號轉(zhuǎn)化為微弱電脈沖信號。由于微生物發(fā)光強(qiáng)度非常低，在0～106個(gè)光子級別，所以倍增管的輸出電壓大小為微伏到毫伏級別，需要外部電路進(jìn)行放大。

　　外部處理采用CC228P作為光電管的高壓電源，光電倍增管輸出微弱的電脈沖信號，經(jīng)過AD603構(gòu)成的電壓放大器放大，以及電壓比較器整形，電路最終輸出了幅度在0～3.3 V之間的標(biāo)準(zhǔn)脈沖。

　　電路輸出的標(biāo)準(zhǔn)脈沖的寬度為2.5 ns，頻率隨脈沖數(shù)的大小而變化，最大頻率范圍約為10 MHz。ATP濃度不同時(shí)，光電倍增管輸出脈沖示意圖如圖5所示。

　　1.3.2 MCU定時(shí)器輸入捕獲

　　由于光電倍增管產(chǎn)生的電脈沖在1 Hz～12.5 MHz，頻率較高，故采用STM32定時(shí)器的輸入捕獲計(jì)數(shù)法。軟件配置好定時(shí)器捕獲模式后，定時(shí)器便進(jìn)入硬件工作，從而有效提高處理器的工作效率。

　　信號采樣模塊使用了輸入捕獲模式以測量脈沖頻率。當(dāng)檢測到TIM1_CH1上出現(xiàn)下降沿時(shí)，計(jì)數(shù)器當(dāng)前值TIM1_

　　CNT加1，存入捕獲比較寄存器TIM1_CCR1中，完成一次捕獲。當(dāng)達(dá)到設(shè)定閾值(65535溢出)，則發(fā)生捕獲中斷，進(jìn)入中斷處理函數(shù)，自定義的整形couter自增1。TIM2每1 s進(jìn)一次中斷，讀取TIM1中的couter和TIM1_CNT，則這1 s的脈沖數(shù)為：conter65535+TIM1_CNT。

2 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

　　微生物檢測系統(tǒng)軟件部分的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)，涉及功能實(shí)現(xiàn)和交互設(shè)計(jì)兩大任務(wù)。鑒于本系統(tǒng)功能需求較為復(fù)雜，觸摸界面與控件繁多，需要存儲用戶配置和歷史記錄，并在PC機(jī)上以文件形式讀寫，本系統(tǒng)選擇采用μC/OS-II+μC/GUI+FatFS+USB的軟件結(jié)構(gòu)作為中間件，其通用的上下層接口，便于編寫規(guī)范的程序以及后續(xù)升級。本章主要圍繞中間件移植和應(yīng)用層實(shí)現(xiàn)兩方面展開詳細(xì)介紹。

　　2.1 中間層詳細(xì)介紹

　　系統(tǒng)軟件架構(gòu)設(shè)計(jì)的目標(biāo)從微觀上講，需要實(shí)現(xiàn)控件對應(yīng)功能，以及界面的狀態(tài)切換?；谏鲜鲆?，系統(tǒng)軟件圍繞軟件結(jié)構(gòu)大致可分為三層：底層硬件驅(qū)動程序，中間層OS、GUI、文件系統(tǒng)以及上層應(yīng)用層用戶程序。

　　本系統(tǒng)中間層包括μC/OS-II、μC/GUI、FatFS和USB協(xié)議，下面介紹上述模塊的移植以及應(yīng)用層調(diào)用接口。

　　2.1.1 μC/OS-II移植

　　μC/OS-II是一個(gè)廣泛應(yīng)用于微控制器的實(shí)時(shí)操作系統(tǒng)內(nèi)核，它包含了任務(wù)調(diào)度、任務(wù)管理、事件管理、內(nèi)存管理和任務(wù)間的通信與同步等基本功能，但是沒有提供輸入/輸出管理、文件系統(tǒng)、網(wǎng)絡(luò)等額外的服務(wù)[5]，所以本系統(tǒng)圖形用戶界面和文件系統(tǒng)都需要單獨(dú)移植。

　　（1）μC/OS-II軟件體系結(jié)構(gòu)

　　μC/OS-II軟件架構(gòu)主要包括以下5大模塊：應(yīng)用程序、μC/OS-II內(nèi)核代碼、μC/OS-II與硬件相關(guān)的代碼、BSP層、Cortex-M4內(nèi)核。其中需要自行編寫的主要是應(yīng)用程序，移植時(shí)需要修改與硬件相關(guān)的代碼，其余部分基本可以沿用μC/OS-II的開源代碼。

　　(2)實(shí)時(shí)操作系統(tǒng)μC/OS-II內(nèi)核移植

　　在移植過程中，需要修改的軟件主要是與處理器相關(guān)的3個(gè)文件，包括設(shè)置庫文件OS_CPU中與處理器和編譯器相關(guān)的代碼，用C語言編寫的6個(gè)與操作系統(tǒng)相關(guān)的函數(shù)C文件，用匯編語言編寫的4個(gè)與處理器相關(guān)的函數(shù)匯編文件。需改寫OS_CPU.H、OS_CPU.C、OS_CPU_

　　A.ASM、startup_stm32f4xx.s、os_cpu_a.asm.s文件[6]。

　　2.1.2 μC/GUI移植

　　Micrium公司開發(fā)的μC/GUI是一種通用嵌入式應(yīng)用的圖形界面軟件，它可為任何使用LCD圖形顯示的應(yīng)用提供一套高效的獨(dú)立于處理器及LCD控制器而設(shè)計(jì)的圖形用戶接口，適用于單任務(wù)或是多任務(wù)系統(tǒng)環(huán)境，通常和μC/OS-II結(jié)合使用。

　　本系統(tǒng)采用μC/GUI 3.90a版本，該版本優(yōu)點(diǎn)是移植時(shí)需要改動的地方少，LCD底層驅(qū)動獲取方便，不依賴于μC/GUI官方驅(qū)動。

　　μC/GUI系統(tǒng)移植主要涉及底層驅(qū)動配置文件，為了適用個(gè)性化的LCD、LCD控制器以及觸摸屏硬件，主要需要修改LCDConf.h、GUIConf.h、LCD底層驅(qū)動這3個(gè)文件。

　　2.1.3 USB驅(qū)動

　　由于USB總線具有通用性、穩(wěn)定性、便利性、高傳輸速率等良好特性[7]，系統(tǒng)選擇USB總線協(xié)議實(shí)現(xiàn)上下位機(jī)通信。根據(jù)系統(tǒng)需求，選用USB2.0規(guī)范，運(yùn)行在全速模式（12 Mb/s）下，PC機(jī)作為主機(jī)，本系統(tǒng)作為設(shè)備。

　　2.2 應(yīng)用層詳細(xì)介紹

　　應(yīng)用層軟件按系統(tǒng)功能需求分為5大模塊：數(shù)據(jù)采集與處理、參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)校正、人機(jī)交互和歷史數(shù)據(jù)查詢。

　　系統(tǒng)上電后首先初始化各硬件模塊，一切正常之后進(jìn)入用戶界面。用戶界面可設(shè)置為英文或中文顯示。在主菜單界面中點(diǎn)擊相應(yīng)控件可進(jìn)入下一級界面，包括：基本測試、測試選擇、測試設(shè)定、測試歷史。

　　進(jìn)行測量時(shí)，應(yīng)首先選定序號，默認(rèn)為上次操作時(shí)選擇的序號。測量方式可設(shè)定為基本測試或平均測試。基本測試時(shí)需要自定義等待時(shí)間、測試時(shí)長。平均測試則需要自定義等待時(shí)間、測試時(shí)長和平行個(gè)數(shù)。

　　在GUI中，使用GUI_WIDGET_CREATE_INFO結(jié)構(gòu)體表示各個(gè)界面，用于存放界面中的控件種類、數(shù)量、ID，結(jié)構(gòu)體原型如下：

　　struct GUI_WIDGET_CREATE_INFO_struct

　　{

　　GUI_WIDGET_CREATE_FUNC* pfCreateIndirect;

　　const char* pName；/*控件指針*/

　　I16 Id；/*ID號，在對話框中唯一標(biāo)示*/

　　I16 x0,y0,xSize,ySize；/*定義位置和大小*/

　　U16 Flags；/*控件的特殊創(chuàng)建標(biāo)志（可選）*/

　　I32 Para；/*控件的特殊參數(shù)（可選）*/

　　}

　　界面消息回調(diào)函數(shù)在發(fā)生事件時(shí)將被自動調(diào)用，并根據(jù)發(fā)生事件的ID進(jìn)入相應(yīng)分支進(jìn)行處理：static void _cbCallback_xxx (WM_MESSAGE* pMsg)。

3 測試與總結(jié)

　　本系統(tǒng)在研發(fā)過程中進(jìn)行了大量前中期測試，為系統(tǒng)軟硬件設(shè)計(jì)和調(diào)整提供了大量依據(jù)。以下將展示系統(tǒng)開發(fā)階段的測試結(jié)果，并給出系統(tǒng)功能與性能測試報(bào)告。

　　3.1 仿真測試

　　理論上，供給生物發(fā)光的ATP含量范圍為0～10-8 mol，對應(yīng)的RLU脈沖頻率范圍是0～8 MHz。在后端數(shù)字系統(tǒng)的開發(fā)階段，可以借助頻率發(fā)生器產(chǎn)生電脈沖信號來模擬RLU，用以測試后端系統(tǒng)對不同頻率脈沖的處理能力，且該頻率精確穩(wěn)定，可以消除外部因素的干擾[3]。表1列出了測試結(jié)果，數(shù)據(jù)表明STM32F407的定時(shí)器模塊可以檢測到0 Hz～12.5 MHz的矩形脈沖，超出12.5 MHz后，計(jì)數(shù)值達(dá)到瓶頸，無法繼續(xù)往上計(jì)數(shù)。由于實(shí)物RLU值主要范圍在0～8 MHz，而且對于超出范圍的樣液，可以通過稀釋的辦法使其ATP的值下降到計(jì)數(shù)范圍內(nèi)。

　　由表1可見，采用定時(shí)器硬件計(jì)數(shù)捕獲輸入法測定的誤差在個(gè)位數(shù)范圍內(nèi)，也在本系統(tǒng)允許誤差范圍內(nèi)，證明定時(shí)器硬件計(jì)數(shù)設(shè)計(jì)是合理的，適合系統(tǒng)需求。

　　3.2 試劑實(shí)物測試

　　本系統(tǒng)整機(jī)測試流程為：開機(jī)自檢校正、取樣、混合、測量、讀數(shù)，如表2所示。

　　光電倍增管需要高壓供給，其供電電壓應(yīng)跟隨靈敏度而改變。若電壓太高，增益噪聲呈倍數(shù)增長，會影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性；若電壓太低，檢測不出低含量的微生物。為此可通過調(diào)節(jié)供電電壓，尋找合適的靈敏度。表3列出了在不同電壓下，光電倍增管捕獲光子數(shù)，即RLU值。

　　從表3可以看出，樣機(jī)在電壓調(diào)至850 V以上出現(xiàn)噪聲，1 310 V以內(nèi)噪聲RLU小于20；電壓越大時(shí)，儀器靈敏度越高，本系統(tǒng)選用1 250 V為常態(tài)下測量電壓，如果靈敏度太高，噪聲將影響測試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。使用者可以根據(jù)待測品的性質(zhì)，在測試前進(jìn)入調(diào)試界面調(diào)整輸入電壓。

　　對不同濃度的待測品，0.5 mL體系下的線性與靈敏度測試結(jié)果如表4所示。

　　檢測靈敏度為10-14 mol ATP，在測試范圍內(nèi)有近線性關(guān)系。ATP含量若低于10-14 mol的級別，本儀器無法精準(zhǔn)測量。

　　在0.5 mL體系下的線性與靈敏度曲線如圖6所示。

　　0.3 mL體系下的線性與靈敏度測試結(jié)果見表5。

　　0.3 mL體系下的線性與靈敏度曲線見圖7。

　　樣機(jī)變壓電源可調(diào)電壓上限為1 310 V，在測試范圍內(nèi)，電壓與RLU成正比。以中等發(fā)光試劑測試，最高檢測靈敏度為ATP 10-18 mol，但在ATP濃度低于10-16 mol時(shí)，可信度較低（重復(fù)性差）。

　　在測試范圍內(nèi)，ATP的量與RLU有較好的線性關(guān)系，線性拐點(diǎn)出現(xiàn)在ATP10-14 mol～10-15 mol之間；在可調(diào)電壓范圍內(nèi)，空機(jī)噪聲低于30 RLU，通常在10～25之間上下波動[10]。

　　本系統(tǒng)測試所用樣液為標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液，向該溶液滴入熒光素酶，ATP能量定量轉(zhuǎn)換為光能，所以該系統(tǒng)在交付時(shí)，除了儀器本身以外，還需要配套化學(xué)試劑。本系統(tǒng)采用廣東省微生物研究所研制的發(fā)光試劑盒，可在各類水、飲料和相關(guān)食品中應(yīng)用，一次測量在30 s以內(nèi)，整個(gè)測量過程不到30 min。測試結(jié)果與美國儀器對比，在可測量范圍內(nèi)結(jié)果相近，且穩(wěn)定、重復(fù)性高。

　　表6給出了本儀器的性能指標(biāo)。

　　最后，對本儀器的相關(guān)性能與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行了比較，如表7所示。

4 總結(jié)

　　從測試數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，ATP含量和細(xì)胞數(shù)、發(fā)光值RLU都存在線性關(guān)系，測定熒光信號的強(qiáng)度，便可得知待檢目標(biāo)被細(xì)菌、食物殘?jiān)任廴镜某潭?，因此檢測ATP可以作為判斷食物潔凈的指標(biāo)。

　　系統(tǒng)基本符合預(yù)定的設(shè)計(jì)目標(biāo)和效果，可快速檢測樣品中微生物含量，具有測定周期短、效率高、判斷標(biāo)準(zhǔn)清晰以及測量范圍寬（10-7 mol～10-16 mol）等特點(diǎn)。

　　同時(shí)，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，基于測量ATP濃度來間接確定微生物含量的方法能滿足測試覆蓋率高達(dá)80%以上的微生物種類，可廣泛應(yīng)用于政府監(jiān)督部門、第三方檢測機(jī)構(gòu)、食品加工行業(yè)、食品和原材料分銷商、飯店、賓館食品操作間、醫(yī)院等領(lǐng)域。

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