癌細(xì)胞分選儀是對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行癌細(xì)胞檢測(cè)、計(jì)數(shù)、分選以及分析的裝置?，F(xiàn)代基于流式細(xì)胞術(shù)的流式細(xì)胞分選儀或分析儀通過(guò)激光激發(fā)熒光的方式^[1]，檢測(cè)細(xì)胞的熒光和散射光來(lái)獲取細(xì)胞的參數(shù)，并通過(guò)分析參數(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或分選等操作。這種方式具有檢測(cè)精度高、分析速度快、分選率高等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用^[2]。

        傳統(tǒng)的細(xì)胞分選儀大多是基于石英管和毛細(xì)管等平臺(tái)，具有集成度比較低、耗費(fèi)樣品量大的缺點(diǎn)^[3]。新興的微流控芯片通過(guò)微機(jī)電技術(shù)(MEMS)，將細(xì)胞處理、檢測(cè)與分選等操作集中在一塊芯片上，大大提高了集成度，并且耗費(fèi)樣品低，是一種應(yīng)用前景廣闊的技術(shù)[4]。本文在微流控芯片的平臺(tái)上，設(shè)計(jì)了癌細(xì)胞分選儀的硬件系統(tǒng)，完成了癌細(xì)胞熒光檢測(cè)電路與用于微流控芯片內(nèi)細(xì)胞分選的高壓脈沖源設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了在微流控芯片上癌細(xì)胞檢測(cè)、計(jì)數(shù)以及分選的結(jié)合。

1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

        整個(gè)儀器包括液滴產(chǎn)生系統(tǒng)、微流控平臺(tái)與激發(fā)光路、主控電路、熒光檢測(cè)電路、高壓脈沖源和細(xì)胞分選系統(tǒng)。系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

　　液滴生成系統(tǒng)通過(guò)恒流泵在微流控芯片內(nèi)通過(guò)流體聚焦將細(xì)胞包裹在液滴中并且在芯片溝道中快速流動(dòng)，激光器(532 nm)發(fā)出的激光經(jīng)過(guò)光路聚焦到芯片溝道一個(gè)點(diǎn)上，對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā)。

        使用北京濱松公司生產(chǎn)的電流輸出側(cè)窗型光電倍增管(PMT)進(jìn)行熒光檢測(cè)^[5]，將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為微弱負(fù)電流信號(hào)，然后通過(guò)熒光檢測(cè)電路的放大、濾波、A/D轉(zhuǎn)換傳送到主控電路，主控電路對(duì)信號(hào)進(jìn)行分析并判斷是否讓高壓系統(tǒng)產(chǎn)生高壓脈沖進(jìn)行細(xì)胞分選。

        系統(tǒng)主控電路采用Atmel公司的Atmega128芯片作為主控芯片，完成與PC通信、采集與處理熒光數(shù)據(jù)、高壓分選系統(tǒng)等功能。

        微流控平臺(tái)示意圖如圖2所示。整個(gè)微流控芯片包括進(jìn)樣口、液滴產(chǎn)生溝道(圖中未畫(huà)出)、主溝道、正負(fù)電極、分選溝道等部分。電極做在溝道兩側(cè)并與溝道處于同一高度，以產(chǎn)生垂直于溝道的均勻電場(chǎng)。

                                                                           圖2微流控芯片示意圖

2 熒光檢測(cè)電路設(shè)計(jì)

        熒光檢測(cè)電路用于檢測(cè)PMT輸出的微弱負(fù)電流信號(hào)。癌細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號(hào)比較微弱，PMT輸出的負(fù)電流范圍為數(shù)百皮安~數(shù)微安。這要求前置放大電路具有低噪聲、高精度的特性^[6]。整個(gè)熒光檢測(cè)電路包括前置變阻放大、濾波電路、DAC電路。

        前置放大電路采用變阻放大的電路結(jié)構(gòu)，如圖3所示。電路的直流增益倍數(shù)取決于反饋電阻R2，根據(jù)V_out=I_in·R2可以計(jì)算前置電路輸出電壓。由相關(guān)文獻(xiàn)可知^[7]，采用一級(jí)放大可以獲得最高的信噪比。為了避免輸入屏蔽電纜的寄生電容^[8]引起電路振蕩，在電路設(shè)計(jì)中加入電容C1,用以補(bǔ)償信號(hào)的相位。反饋電阻R2并聯(lián)合適的反饋電容C2，限制信號(hào)的帶寬。R3和C3在信號(hào)回路中形成一個(gè)低通濾波器，抑制由于背景光引起的噪聲和電阻R2的熱噪聲，同時(shí)避免了產(chǎn)生很大的負(fù)載效應(yīng)^[9]。

                                                                                   圖3 前置放大電路

        由于要檢測(cè)微弱的負(fù)電流信號(hào)，所以對(duì)于運(yùn)算放大器U1有較高的要求。運(yùn)放應(yīng)當(dāng)具備極小的輸入偏置電流、噪聲低和較大帶寬增益積的特性。綜合以上考慮，設(shè)計(jì)中選擇了美國(guó)Linear公司的CMOS輸入型精密運(yùn)放LTC6240HV，該運(yùn)放的性能參數(shù)有：(1)0.1 Hz~10 Hz噪聲為550 n V_p-p；(2)輸入偏置電流IB：典型為0.2 pA，最大為1 pA；(3)帶寬增益積：18 MHz。在實(shí)際的電路測(cè)試中，該運(yùn)放對(duì)弱電路的檢測(cè)能力滿(mǎn)足系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)精度的要求。

3 可調(diào)高壓脈沖源設(shè)計(jì)

        設(shè)計(jì)的高壓脈沖源用于產(chǎn)生0~1 200 V范圍的可變寬度的脈沖信號(hào)，形成垂直電場(chǎng)加在微流控芯片的溝道兩側(cè)，以分選檢測(cè)到的癌細(xì)胞液滴。分選時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)脈沖的寬度和高度來(lái)達(dá)到最優(yōu)的分選效果。

        可調(diào)高壓脈沖發(fā)生器的結(jié)構(gòu)如圖4所示，整個(gè)電路包括了可調(diào)直流高壓模塊，DAC高壓調(diào)節(jié)電路、IGBT以及IGBT驅(qū)動(dòng)電路等部分。電路采用兩個(gè)IGBT組成半橋結(jié)構(gòu)，采用懸浮驅(qū)動(dòng)技術(shù)^[10]，避免了采用單個(gè)IGBT時(shí)由于負(fù)載太輕而導(dǎo)致關(guān)斷時(shí)放電太慢，形成下降沿不夠陡峭的問(wèn)題。通過(guò)單片機(jī)的控制信號(hào)控制IGBT驅(qū)動(dòng)器，從而控制上下兩個(gè)IGBT的導(dǎo)通與關(guān)斷，形成脈沖寬度可調(diào)的脈沖信號(hào)。單片機(jī)控制DAC輸出不同電平的高壓調(diào)節(jié)信號(hào)控制高壓模塊，來(lái)獲得0~1 200 V范圍內(nèi)的脈沖峰值。系統(tǒng)中采用的直流高壓模塊為恒博可調(diào)高壓，輸出電壓為0~1 200 V，IGBT為FGA25N120ANTD，耐壓值為1 200 V, IGBT驅(qū)動(dòng)器采用exb841模塊。

                                                                    圖4 可調(diào)高壓脈沖源結(jié)構(gòu)框圖

        在電路測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，IGBT切換產(chǎn)生脈沖時(shí),會(huì)產(chǎn)生比較大的電壓尖峰，當(dāng)設(shè)置的電壓較高時(shí)，產(chǎn)生的電壓尖峰很可能會(huì)對(duì)電路元件產(chǎn)生損壞，因此在電路中加入了尖峰吸收與緩沖電路，如圖5所示。

                                                                             圖5 尖峰吸收與緩沖電路

        電路中D2與D3構(gòu)成雙向限幅電路，將驅(qū)動(dòng)電壓限制在-5 V~+15 V，R5與C8組成RC電路設(shè)定脈沖上升與下降時(shí)間，以消除電壓尖峰，RC時(shí)間常數(shù)越大，消除尖峰效果越好，但同時(shí)脈沖上升與下降時(shí)間變長(zhǎng)，測(cè)試中發(fā)現(xiàn)R5取10 Ω，C8取20 pF時(shí)，可以獲得比較良好的消峰與脈沖邊沿特性。D1與C7用于保護(hù)exb841內(nèi)部的穩(wěn)壓管。

4 系統(tǒng)測(cè)試

4.1熒光檢測(cè)電路測(cè)量精度測(cè)試

        直流信號(hào)下，檢測(cè)電路輸出的結(jié)果與五位半萬(wàn)用表測(cè)量結(jié)果相比，偏差小于50 μV。

        在電路懸空輸入(輸入電流為零)情況下測(cè)試電路噪聲與分辨力，當(dāng)采樣率為10 Hz時(shí)，得到的輸出噪聲曲線(xiàn)如圖6所示?？梢钥吹皆诖瞬蓸勇氏码娐繁旧碓肼昖_p-p小于5 μV，根據(jù)反饋電阻為100 kΩ，等效輸入電流噪聲為50 pA，可認(rèn)為電路具有100 pA量級(jí)的輸入電流信號(hào)分辨能力，滿(mǎn)足系統(tǒng)的測(cè)量要求。采樣率上升時(shí)，ADC引起的噪聲會(huì)有所增加。

                                                                              圖6 電路噪聲測(cè)試

        采用檢測(cè)電路檢測(cè)濃度為8×10⁴/mL的乳腺癌細(xì)胞熒光曲線(xiàn)如圖7所示。細(xì)胞懸浮液中的雜質(zhì)會(huì)引起一些較低的峰，使用無(wú)癌細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)引起的峰一般小于400 mV，可以通過(guò)設(shè)定這個(gè)電壓作為閾值來(lái)判斷檢測(cè)到的峰是否是細(xì)胞引起的。從圖中可以看到，5 s內(nèi)檢測(cè)到了6個(gè)癌細(xì)胞。

                                                                              圖7 癌細(xì)胞熒光檢測(cè)結(jié)果

4.2 高壓脈沖信號(hào)源測(cè)試

        經(jīng)過(guò)單片機(jī)軟件的線(xiàn)性偏差修正后，高壓脈沖的峰值與預(yù)設(shè)值之間偏差小于1 V，具有較高的精度，滿(mǎn)足系統(tǒng)的要求。

        脈沖的上升時(shí)間和下降時(shí)間可以通過(guò)IGBT的基極串聯(lián)電阻來(lái)調(diào)節(jié),以取得脈沖過(guò)沖尖峰大小和上升、下降時(shí)間大小的平衡,在本設(shè)計(jì)中取基極串聯(lián)電阻為10 ?贅，得到的1 200 V左右時(shí)脈沖上升下降波形如圖8所示?？梢钥吹矫}沖上升、下降時(shí)間都約為10 μs，脈沖源最高可以產(chǎn)生頻率為20 kHz的高壓脈沖信號(hào)。

                                                              圖8 高壓脈沖的上升、下降沿測(cè)試圖

4.3 細(xì)胞分選的測(cè)試

        用羅丹明液滴模擬帶有癌細(xì)胞的液滴進(jìn)行細(xì)胞分選。當(dāng)檢測(cè)到超過(guò)閾值的熒光脈沖時(shí)，系統(tǒng)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后產(chǎn)生一個(gè)脈沖分選出對(duì)應(yīng)的液滴。圖9是在顯微鏡下觀察到的一組結(jié)果。

        從圖9中可以看到,在電極上加上600 V、50 ms脈寬的高壓脈沖后，待分選的液滴發(fā)生偏離，而其余的液滴不受影響,最后成功將待分選液滴分選到左側(cè)的溝道當(dāng)中。

                                                                     圖9 高壓脈沖分選細(xì)胞測(cè)試圖

        設(shè)計(jì)的基于微流控芯片的流式細(xì)胞分選系統(tǒng)采用AVR單片機(jī)為核心處理器，完成了微弱細(xì)胞熒光的檢測(cè)電路的設(shè)計(jì)、細(xì)胞分選高壓脈沖電路以及控制電路設(shè)計(jì)，在單片微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的檢測(cè)、計(jì)數(shù)以及分選。系統(tǒng)的硬件部分已經(jīng)初步完成，經(jīng)過(guò)測(cè)試，硬件各方面的參數(shù)均能滿(mǎn)足系統(tǒng)的要求，為后期系統(tǒng)的整合和優(yōu)化打下了比較好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 葉曉蘭, 杜文斌, 古淑青,等. 基于正交光路系統(tǒng)的小型流式細(xì)胞儀的研究[C]. 中國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)第十四屆有機(jī)分析及生物分析學(xué)術(shù)研討會(huì)會(huì)議論文摘要集, 2007.

[2] 高健, 殷學(xué)鋒, 方肇倫. 微流控芯片系統(tǒng)在單細(xì)胞研究中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)進(jìn)展，2004，16(6):975-983.

[3] HOLMES D, MORGAN H, GREEN N G. High throughput particle analysis: Combining dielectrophoretic particle focussing with confocal optical detection. Biosensors and Bioelectronics,  2006,21(8):1621-1630.

[4] YANG S Y, HSIUNG S K, HUNG Y C, et al. A cell couing/sorting system incorporated with a microfabricated flow cytometer chip. Measurement Science and Technology, 2006,17(7):2001-2009.

[5] 郭從良, 孫金軍, 方容川,等. 光電倍增管的噪聲分析和建模[J]. 光學(xué)技術(shù), 2003，29(5)：636-640.

[6] 何瑾, 劉鐵根, 孟卓,等. 弱光強(qiáng)信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)前級(jí)放大電路的設(shè)計(jì)[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程,2007,7(9)：1904-1906.

[7] 李雙喜. 熒光微弱信號(hào)檢測(cè)電路設(shè)計(jì)[J]. 電子工程師, 2005,31(2)：52-54.

[8] 楊茂, 胡立群, 毆艷敏,等.微弱光電流信號(hào)放大器的設(shè)計(jì)[J].核電子學(xué)與探測(cè)技術(shù), 2011,31(7)：734-738.

[9] 賽爾吉?dú)W·佛朗哥. 基于運(yùn)算放大器和模擬集成電路的電路設(shè)計(jì)[M]. 第3版. 劉樹(shù)棠，朱茂林，榮玫，譯.西安：西安交通大學(xué)出版社， 2009：297-298.

[10] 王松雁, 武洪臣, 王小峰,等. 絕緣柵雙極晶體管固體開(kāi)關(guān)技術(shù)研究[J]. 強(qiáng)激光與粒子束, 2002,14(6):954-956.